밀리셀® 인서트를 이용한 소장 오가노이드 유래 단일층 배양
2.5차원 세포 배양이란 무엇인가?
2.5D 세포 배양에서는 연구자들이 세포 배양 인서트와 같은 물리적 지지체 위에 생물학적 코팅 또는 합성 폴리머를 도포한 2차원 단일층 세포를 배양합니다. 이는 주로 3차원 배양과 연관된 분화된 구조의 성장을 촉진하고 부착 및 분화를 향상시킵니다.
3차원 오가노이드 배양은 생리적 특징과 생물학적 복잡성을 더 잘 반영하는 등 2차원 단일층 모델에 비해 여러 장점을 제공하지만, 장벽 무결성 평가, 약물 유입/유출, 이동 및 침습, 상처 치유 분석과 같은 트랜스상피전기저항(TEER)과 같은 응용 분야에는 적합하지 않습니다. 이러한 중요한 문제를 해결하기 위해 오가노이드는 단일 세포로 분해되어 2.5D 배양에서 단층으로 막 위에 배양됩니다.
소장은 약물 흡수 부위이며 약물 독성, 투과성, 유입/유출을 평가하는 데 매우 적합한 모델입니다. 3D 체외 배양에서 장 오가노이드는 기포 모양 구조를 형성하며, 구조의 내부(첨단면)는 관강(흡수면)에, 외부(기저측면)는 혈관 접촉면에 해당합니다. 이러한 구조는 아피칼 측에서 흡수되는 화합물 치료를 어렵게 만듭니다. 그러나 동일한 오가노이드 라인을 막 삽입체(transmembrane insert)에 배양하면, 삽입체 상단에 아피칼 측, 하단에 기저측이 위치한 극성화 단일층이 형성되어 약물 투과성과 장벽 무결성 평가가 가능해집니다(그림 1).
그림 1.밀리셀® 막 삽입체에서 8일간 배양된 인간 십이지장 환자 유래 오가노이드(PDO)의 단면. 극성화된 상피 단일층을 보여줌. 상피층은 단면 상단에 분홍색으로, 밀리셀® 막은 단면 하단에 흰색으로 위치함.
현재 장 장벽 분석의 표준 모델은 대장암 세포주인 Caco2입니다. 그러나 긴 배양 기간(약 20일)과 대장 특성은 주요 흡수 기관인 소장에 대한 약물 효과를 정확히 평가하는 데 불리합니다.
2.5D 시스템을 사용하면 연구자들은 더 긴 시간 경과에 걸쳐 모니터링하고, 단기 분석으로는 놓칠 수 있는 누적 약물 독성과 같은 부작용을 관찰할 수 있습니다. 예를 들어, 프로스타사이클린 약물은 용액에서 반감기가 매우 짧아 장기적 효과를 확인하기 어렵습니다. 본 연구에서는 소장 유래 3dGRO® 십이지장 오가노이드(Duo-87)를 이용한 2.5D 배양법을 통해 장기적 약물 부작용 및 독성을 모니터링하는 방법을 제시합니다.
밀리셀® 인서트에서 소장 단일층 배양
재료 및 방법
- 3dGRO® 십이지장 오가노이드 Duo-87 (SCC322)
- 3dGRO® L-WRN 조건화 배지 보충제 (SCM105)
- TrypLE Express
- Matrigel®
- 투명 PET 막이 있는 Millicell® 24-웰 행잉 인서트
- Millicell® 96웰 플레이트, 1 µm 기공 크기, 투명 PET 멤브레인 (PSRP004)
- 멀티웰 플레이트
- Millicell® ERS 3.0 디지털 전압-저항 측정기 (MERS03000)
- Millicell® ERS 3.0 96-웰 전극 (MERS0396P)
TrpLE Express 세포 분해 시약을 사용하여 완전한 L-WRN 배지에서 배양 5일째에 환자 유래 오가노이드(PDO) 소장 모델 Duo-87을 단일 세포로 분해합니다. 분해된 Duo-87 세포를 2% GFR Matrigel® 코팅된 Millicell® 24-웰 매달린 세포 배양 인서트를 사용한 멀티웰 플레이트에서 배양합니다(워크플로우 1). Millicell® ERS 3.0 볼트옴미터를 사용하여 상피간 전기 저항(TEER)을 측정합니다.
워크플로우
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2단계
~10 x 10 µL 돔으로 100k 세포를 생산함
3단계
200k/삽입 필요 ~20 x 10 µL 돔
4단계
24개의 인서트에 사용할 약 240 x 10 µL 돔이 필요합니다.
워크플로우 1. 24-웰 인서트 플레이트에 시드하기 위해 필요한 SCC322 Duo-87 오가노이드 및 단일 세포의 대략적인 수.
그림 2.1.0 µm 기공 크기의 96-웰 Millicell® 플레이트에서 배양된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값. 증식 배지(L-WRN, 분홍색)에서 분화 배지(ENR, 파란색)로 전환된 웰에서 TEER 값이 증가함. L-WRN 배지에서 배양된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값은 시간 경과에 따라 정점을 보이지 않는 반면, ENR 배지에서 배양된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값은 10일차에 정점을 보인 후 12일차에 시작값으로 점차 감소합니다.
십이지장 유래 PDO 단일 세포를 24-웰 Millicell® 인서트에 접종하여 10일차에 완전한 단일층을 형성하였다. TEER 값을 매일 측정하여 배양 25-28일 후 자연적으로 분해될 때까지 단일층의 건강 상태를 평가하는 시간 경과 데이터를 생성하였다. 프로스타사이클린 처리된 Duo-87 오가노이드의 경우 11일 후 TEER 값이 급격히 감소했습니다. 이는 약물이 세포막 무결성에 미치는 누적 효과를 시사합니다(그림 3).
그림 3.1.0 µm 기공 크기의 Millicell® 24-well 인서트에 배양된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값. 대조군(파란색, 원) 용액, 100 µM 프로스타사이클린(분홍색, 삼각형), 또는 50 µM 프로스타사이클린(보라색, 사각형) 처리군. 대조군 처리된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값은 시간 경과에 따라 점진적으로 증가한다. 100 µM 및 50 µM 프로스타사이클린 처리된 Duo-87 오가노이드의 TEER 값은 11일까지 증가한 후 급격히 하락한다.
2.5차원 세포 배양은 약물 독성을 연구하는 과학자들이 종점 세포 생존율 분석법으로는 감지되지 않는 미묘한 효과를 밝혀내는 데에도 도움이 될 수 있다. 장내 내약성이 낮은 항암제 아파티닙은 매우 강력한 효능을 지녔으나 설사 유발 부작용 발생률이 96%에 달합니다. 시험관 내에서 십이지장 단일층에 0.5 µM 아파티닙을 처리하면 세포 사멸과 단일층 붕괴가 발생합니다. 그러나 더 낮은 농도에서는 시간 경과에 따른 TEER 값 증가가 용량 의존적 지연을 보입니다(그림 4).
그림 4. 아파티닙 처리된 1.0 µm 기공 크기 Millicell® 24-웰 인서트 상의 Duo-87 오가노이드의 TEER 값. A.) 대조 용액(파란색) 또는 0.5 µM 아파티닙(보라색) 처리 시 Duo-87 TEER 값. 이 농도에서 TEER 값은 점차 증가한 후 급격히 감소하여 세포 사멸을 나타냄. B). 대조 용액(파란색), 0.06 µM 아파티닙(보라색), 또는 0.02 µM 아파티닙(분홍색) 처리 시 Duo-87 TEER 값. IC50 값인 0.5 µM 미만의 아파티닙 용량을 증가시킬수록 TEER 값 증가가 용량 의존적으로 지연되는 현상이 관찰된다.
