인플릭시맙 및 아달리무맙의 다중 정량 분석
초록
인플릭시맙과 아달리무맙 단일클론 항체(mAbs)는 종양괴사인자-알파(TNFα)에 결합하여 염증 반응을 감소시킴으로써 류마티스 관절염, 건선성 관절염 및 다양한 자가면역 질환 치료에 널리 사용됩니다. 혈중 약물 농도 부족 및 자가항체 형성으로 인해 환자 간 임상 반응이 상이하며, 이는 ELISA 검사에 간섭을 일으킬 수 있다. 따라서 혈청 인플릭시맙 및 아달리무맙 mAbs 정량화를 지원할 신뢰성 있는 LC-MS/MS 검사에 대한 수요가 증가하고 있다. 이러한 항체의 정확한 정량화는 분석 워크플로우 전반에 걸쳐 천연 표적 단백질과 동일하게 행동하는 내부 표준물질의 조기 도입으로 가능해진다. 머크는 전체 길이의 안정 동위원소 표지(SIL) 인플릭시맙 및 아달리무맙 mAb 내부 표준물을 개발하여 LC-MRM 분석법을 이용한 혈청 인플릭시맙 및 아달리무맙의 일상적 정량에서 정확도와 재현성을 크게 개선하였습니다.* 머크는 면역 농축 없이 인플릭시맙 및 아달리무맙에 대해 15% 미만의 CV와 ± 15% 정확도로 500 ng/mL의 낮은 정량 한계를 입증합니다.
방법
SIL-인플릭시맙 및 SIL-아달리무맙은 13C615N4 아르기닌과 13C615N2 라이신이 풍부한 무혈청 배지에서 배양된 CHO 세포에서 발현되었습니다. SIL 표지된 단일클론항체(mAbs)는 완전 단백질 수준과 트립신 분해 후 분석되었다. 완전 단백질 질량 분석(SEC-MS)을 통해 단백질의 아미노산 구성과 당화 수준을 확인하였다. 트립신 분해 후 펩타이드 수준에서 서열 및 동위원소 도입을 확인하였다. 정량화를 위해, 표적 항체가 0.5~100 µg/mL 포함된 인간 혈청에 SIL-인플릭시맙 및 SIL-아달리무맙을 내부 표준으로 20 µg/mL 첨가하여 시료를 준비하였다. 포화 황산암모늄을 첨가하여 시료를 침전시킨 후, 50 mM 암모늄 중탄산염으로 재구성하고 분해하였다. 트립신 분해 펩타이드를 Supelco BIOshell A160 Peptide C18, 2.7 µm 융합 코어 입자 컬럼(10 cm x 500 µm)에서 분리하였다. 검출은 Sciex QTRAP 5500 시스템에서 MRM 모드로 수행하였다. 인플릭시맙 고유 펩타이드 4종과 아달리무맙 고유 펩타이드 1종의 전이(transition)를 모니터링하였다.
SEC-MS 분석
그림 1.환원된 인플릭시맙 및 아달리무맙의 SEC-MS 분석 결과로 얻어진 UV 트레이스와 디콘볼루션된 질량 스펙트럼.
동위원소 동화 분석
그림 2.인플릭시맙 및 아달리무맙의 선별된 펩타이드에 대한 13C615N4 표지 아르기닌 및 13C615N2 표지 라이신 도입. 도입률은 99% 이상으로 확인되었다.
인플릭시맙 및 아달리무맙의 LC-MRM 분석
그림 3.인플릭시맙의 고유한 펩타이드 하나와 아달리무맙의 고유한 펩타이드 하나에 대한 추출 이온 크로마토그램(XIC).
정량화
그림 4.인플릭시맙 및 아달리무맙의 고유 트립신 분해 펩타이드에 대한 교정 곡선은 0.5~100 µg/mL의 표적 항체를 함유한 인간 혈청에 20 µg/mL의 내부 표준물질(IS)을 첨가하여 얻었다.
요약
- 고순도 및 99% 이상의 동위원소 함유율을 가진 안정 동위원소 표지된 전체 길이 인플릭시맙 및 아달리무맙 단일클론항체(mAbs)가 생산되었습니다.
- 전체 길이 SIL-인플릭시맙 및 SIL-아달리무맙 내부 표준을 사용함으로써 인간 혈청 내 표적 항체의 민감하고 정확하며 재현성 있는 다중 정량 분석이 가능함을 입증하였다.*