HPLC 및 UHPLC 분석용 물
고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 많은 실험실에서 핵심 장비로 자리 잡은, 검증되고 신뢰할 수 있는 기술입니다. HPLC는 견고한 기술이지만, 사용되는 시약의 품질에 큰 영향을 받습니다. HPLC에서 가장 중요한 시약 중 하나는 물인데, 이는 특히 역상 HPLC에서 HPLC 이동상의 주요 성분으로 자주 사용되기 때문입니다. 물에 포함된 불순물은 HPLC 결과와 기기 성능에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다.
HPLC 개요
HPLC는 분석 화학 분야에서 가장 강력한 도구 중 하나입니다. HPLC는 액체에 용해될 수 있는 다양한 시료에 존재하는 광범위한 극성 범위의 화합물을 분리, 동정 및 정량할 수 있습니다. 이 기술은 제약, 환경, 임상, 법의학, 식품, 기능성 식품 및 산업용 화학 시료와 같이 거의 모든 종류의 시료에 적용될 수 있어 민감도가 높고 활용도가 뛰어납니다.
원칙
HPLC에서는 컬럼에 충전된 고정상과 컬럼을 통해 펌핑되는 액체 이동상 사이에 분석물이 분배됨으로써 분리가 이루어집니다. 시료 내의 성분들은 고정상과 서로 다른 방식으로 상호작용하며, 극성, 전하, 크기 또는 친화도에 따라 분리됩니다. 분자들이 컬럼을 빠져나오면 자외선(UV), 형광, 질량 분석법 또는 기타 검출기를 통해 검출됩니다.
HPLC 시스템은 적절한 튜브와 피팅으로 연결된 6가지 기본 모듈, 즉 용매 저장통, 펌프, 주입기, 컬럼, 검출기 및 데이터 시스템으로 구성됩니다(그림 1).
그림 1.HPLC 기기의 개략도
초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)
초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)는 더 작은 고정상 입자(UHPLC의 경우 < 2 µm, HPLC에서 일반적으로 사용되는 3-5 µm 대비)와 더 높은 압력(UHPLC의 경우 최대 1500 bar, HPLC의 경우 300-600 bar 대비)을 활용하여 HPLC보다 더 빠른 분석 시간, 더 높은 감도, 더 높은 분해능 및 더 우수한 재현성을 달성합니다. 또한, UHPLC는 평형화 시간과 분석 시간이 짧아 시료당 용매 소비량이 적습니다. 이 기술은 고처리량 분석, 복잡한 시료 분석, 또는 시료 양이 제한적인 경우에 가장 적합한 방법입니다. 또한 HPLC에 비해 더 빠른 분리와 적은 용매 소비를 가능하게 하므로 친환경 화학 분야에서도 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 더 높은 압력이 필요하기 때문에, UHPLC는 높은 시스템 압력을 견딜 수 있는 장비가 필요합니다.
이 HPLC 방법 이전 계산기를 사용하여 HPLC 조건에서 UHPLC 조건으로 방법을 이전할 때 절약되는 분석 시간과 용매 소비량을 확인하십시오.
HPLC 분리 모드
HPLC 분리는 시료의 물리화학적 특성에 따라 수행될 수 있습니다:
정상상 크로마토그래피 (NP-HPLC)
정상상 HPLC에서는 고정상이 극성 물질(예: 실리카)이며, 이동상은 상대적으로 비극성 물질(예: 헥산, 에틸 아세테이트)을 사용합니다. 이 고전적인 크로마토그래피 방식은 천연물, 지질, 당류 및 기타 극성 화합물을 분리하는 데 일반적으로 사용됩니다. 이 크로마토그래피 방식에서는 일반적으로 물을 사용하지 않습니다.
역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)
역상 HPLC는 정상상과 반대되는 방식입니다. 정상상보다 더 널리 사용되며, 전체 분리의 75% 이상을 차지합니다. 역상 HPLC에서는 컬럼에 소수성 입자(예: C18 결합 실리카)가 충전되어 있습니다. 이동상은 물(또는 산이나 염기, 완충액으로 변형된 물)과 메탄올, 아세토니트릴과 같은 유기 용매의 혼합 가능한 조합입니다. 이 기술은 매우 다용도로, 소분자 의약품, 펩타이드, 뉴클레오티드(DNA/RNA 단편), 농약 또는 방부제와 같은 비극성 또는 중등도 극성 화합물을 분리하는 데 널리 사용됩니다.
이온 교환 크로마토그래피 (IEX-HPLC)
이온 교환 크로마토그래피는 고정상과 이온적 상호작용을 기반으로 전하를 띤 분자를 분리하는 데 사용되는 강력한 기법입니다. 고정상은 고정된 전하를 가지고 반대 전하의 이온을 끌어당기는 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지일 수 있습니다. 이동상은 일반적으로 수용액이나 완충액입니다. 분리는 분석물이 수지에 끌리는 힘에 따라 결정되며, 이는 분석물의 전하와 전하 밀도에 기초합니다.
크기 배제 크로마토그래피(SEC)
입자 크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 겔 투과 크로마토그래피라고도 하며, 용액 내 분자의 크기에 따라 분자를 분리하는 데 사용되는 기법입니다. 컬럼에는 정해진 기공 크기를 가진 다공성 비드(예: 아가로스)가 들어 있습니다. 더 큰 분자는 비드의 기공으로 들어갈 수 없기 때문에 이동 거리가 짧아지며, 기공을 통해 더 먼 거리를 이동하는 작은 분자보다 먼저 검출기에 도달합니다. 이 방법은 단백질, 고분자, 바이러스 입자 또는 나노입자와 같은 분자를 분리하는 데 사용됩니다.
친화성 크로마토그래피
친화성 크로마토그래피는 생물학적 상호작용을 기반으로 복잡한 혼합물에서 특정 분자를 정제하는 데 사용되는 매우 선택적인 기법입니다. 또한 수용체 연구에도 활용될 수 있습니다. 컬럼에는 분석물 특이적이거나 그룹 특이적인 친화성 리간드로 코팅된 아가로스 비드가 들어 있습니다. 분석물은 매우 특이적인 방식으로 리간드를 인식하고 결합합니다. 그런 다음 pH나 이온 강도를 변경하거나 경쟁 리간드를 첨가하여 표적 분자를 용출시킵니다.
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
HIC는 단백질 및 단백질 복합체의 생물학적 활성을 유지하면서 이를 정제하는 데 사용됩니다. 분자들은 소수성에 따라 분리됩니다. 시료는 고염분 완충액에 도포되며, 염 농도를 점진적으로 낮추어 분자들을 용출시킵니다. 이 방법은 소수성 분석물 부분과 소수성 고정상 리간드 간의 상호작용 정도에 따라 분석물을 분리합니다.
수질 오염 물질이 HPLC에 미치는 영향
HPLC에서 가장 흔히 발생하는 문제 중 하나는 용매/이동상의 품질과 관련이 있습니다. (이 기사에서 유용한 팁과 요령을 확인해 보세요.) 물은 특히 역상 HPLC에서 HPLC 이동상의 주요 성분으로 자주 사용되므로 신중하게 선택해야 합니다. 또한 물은 블랭크로 사용되거나, 시료 전처리 및 표준 곡선 작성에 활용됩니다.
물의 오염 물질은 여러 가지 방식으로 HPLC 분석이나 HPLC 기기에 영향을 미칠 수 있습니다.
유기물
HPLC에 사용되는 물의 유기물 오염은 크로마토그래피 분리에 다음과 같은 다양한 방식으로 영향을 미칠 수 있습니다:
잡음이 발생하거나 베이스라인이 드리프트될 수 있으며, 분석 대상 화합물과 함께 용출되어 동정 및 정량 분석을 더욱 어렵게 만들 수 있습니다. 결과적으로, 크로마토그래피 분리에 사용되는 물에 유기물이 존재하면 분석 크로마토그래피 방법의 감도가 저하될 수 있습니다.
유기물은 컬럼 상단에 축적되었다가 오염 물질이나 고스트 피크로 용출될 수 있습니다.
유기물 오염 수준이 매우 높으면 유지 시간의 변화, 피크 형태의 왜곡 및 피크 테일링을 유발할 수 있습니다. 이는 분해능 저하로 이어져 동정 및 정량 분석을 어렵게 만들 뿐만 아니라, 실험의 재현성에도 영향을 미칩니다.
컬럼 내 유기 물질의 축적은 물질 전달 문제를 일으켜 분해능 저하를 초래하고, 궁극적으로 컬럼 수명을 단축시킬 수 있습니다.
이러한 모든 이유로, HPLC 분석에 사용되는 물의 유기물 농도를 정확하게 모니터링하는 것이 매우 중요하며, 이는 TOC 모니터 또는 TOC 지시기를 사용하여 편리하게 수행할 수 있습니다.1
입자
입자는 펌프와 주입기를 손상시킬 수 있습니다. 또한 컬럼과 프리트를 막아 배압을 증가시킬 수도 있습니다. 입자는 2차 고체상으로 작용하여 시료 성분을 결합시킬 수도 있습니다.
입자의 영향은 입자 크기가 더 작고, 간극 공극 부피가 더 작으며, 컬럼 직경이 더 얇고, 유속이 더 높은 UHPLC에서 더욱 두드러집니다. 매우 작은 입자로 채워진 컬럼은 입자가 더 큰 HPLC 컬럼에 비해 입자로 인한 조기 막힘에 더 취약합니다.
콜로이드
콜로이드는 고정상에 비가역적으로 흡착되어 컬럼의 원래 분리 효율을 상실시킬 수 있습니다.
박테리아
세균은 컬럼과 프리트에 침투하여 유기 부산물을 방출할 수 있습니다(유기 오염의 영향 참조).
이온
이온 오염 또한 크로마토그래피 분리에 영향을 미칠 수 있습니다. 용액의 이온 강도가 변하면 일부 분리에 영향을 줄 수 있으며, 이온 오염 물질이 자외선을 흡수하는 이온(예: 질산염, 아질산염)인 경우 피크로 나타나 데이터 분석을 어렵게 만듭니다.
연구: 재현성 있는 UHPLC 분석을 위한 수질의 중요성
UHPLC에서는 시료 희석, 표준 용액 및 이동상 조제에 물이 사용됩니다. UHPLC에 저품질 물을 사용하면 데이터 품질과 시스템 성능에 즉각적이고 장기적인 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 유기 오염 물질은 UHPLC 크로마토그램의 품질에 가장 큰 영향을 미칠 수 있는 불순물로, 고스트 피크, 노이즈가 많은 베이스라인 또는 낮은 재현성을 유발합니다. 또한 유지 시간의 점진적인 변화나 분해능 저하를 초래할 수도 있습니다.
Milli-Q® 초순수가 UHPLC 분석에 적합함을 입증하기 위해, 7가지 화합물의 혼합물을 그라디언트 용출법(3분 동안 80% 물/20% 아세토니트릴에서 10% 물/90% 아세토니트릴로 변화시킨 후, 1분 동안 등용매 상태로 유지한 다음 초기 조건으로 되돌리는 방식)을 사용하여 반복적으로 분석했습니다.
Milli-Q® IQ 7003 초순수 시스템과 유사한 Milli-Q® 순수 및 초순수 시스템을 사용했으며, 이 시스템에는 Millipak® 최종 필터가 장착되어 있었습니다.
600회의 연속 주입에 걸쳐 안정적인 유지 시간, 피크 면적 및 형태가 관찰되었으며, 이는 초순수가 검출 가능한 유기 오염 물질을 유입하지 않았음을 나타냅니다. 그림 2는 1회차와 600회차의 크로마토그램을 비교하여 이러한 견고성을 보여주고 있으며, 두 크로마토그램은 거의 동일합니다.
이러한 결과는 갓 정제된 Milli-Q® 초순수가 신뢰할 수 있고 재현성 높은 UHPLC 성능을 보장하는 데 도움이 됨을 확인해 줍니다.2
그림 2.254 nm에서 측정된 7가지 화합물 혼합물의 UHPLC 크로마토그램. A: 첫 번째 분석; B: 600번째 분석. (1: 2-아세틸푸란, 2: 아세타닐리드, 3: 아세토페논, 4: 프로피오페논, 5: 부틸파라벤, 6: 벤조페논, 7: 발레로페논)
HPLC용 정제수
HPLC 및 UHPLC 분석에는 유기 오염도가 낮음을 나타내는 TOC 5 ppb 미만, 이온성 오염 물질이 매우 적음을 나타내는 18.2 MΩ·cm의 저항률, 그리고 미립자 및 박테리아를 제어하기 위한 0.22 µm 여과 과정을 거친 갓 정제된 초순수(Type 1)를 사용하는 것이 권장됩니다. TOC 모니터 또는 표시기가 내장된 정수 시스템을 선택하면, 분석에 간섭을 일으키거나 데이터 정확도를 저하시킬 수 있는 유기 오염 물질이 물에 포함되지 않도록 보장할 수 있습니다.
HPLC 또는 UHPLC를 사용하는 과학자들을 위해 다양한 정수 솔루션이 제공됩니다.