Métodos de ensayo de pirógenos

Las endotoxinas son sustancias que se encuentran en las bacterias gramnegativas. Los pirógenos no endotóxicos son otras sustancias microbianas, incluidas las derivadas de bacterias grampositivas o virus y los pirógenos procedentes de levaduras y hongos. Las sustancias pirógenas no microbianas también pueden proceder de partículas de caucho, partículas microscópicas de plástico o compuestos metálicos en elastómeros.

Existen varios métodos de ensayo para la detección de pirógenos. Se pueden clasificar en función del tipo de contaminante que detectan y de la necesidad de utilizar materiales de origen animal para realizar el ensayo, tal y como se describe en la tabla siguiente:

Prueba de pirógenos en conejos

La prueba de pirógenos en conejos (RPT) consiste en medir el aumento de temperatura de los conejos tras la inyección intravenosa del producto sometido a prueba. La RPT ofrece resultados cualitativos y su sensibilidad es bastante baja. La solidez de la prueba también es limitada, debido al desarrollo de tolerancia a los pirógenos en los conejos tras inyecciones repetidas, o al estrés que sufren los conejos al realizar el ensayo.

Nota: La prueba de pirógenos en conejos (RPT) está ahora prohibida en Europa, y la prueba de activación de monocitos (MAT) es el método elegido para detectar pirógenos endotóxicos y no endotóxicos.

Prueba de activación de monocitos

La prueba de activación de monocitos (MAT) es una alternativa a los métodos basados en animales para la detección de pirógenos endotóxicos y no endotóxicos. La prueba de activación de monocitos imita la reacción inmunitaria humana mediante la incubación de monocitos con la muestra analizada. Si hay pirógenos presentes, los monocitos se activan y producen moléculas inflamatorias, las citocinas, responsables de la reacción febril. A continuación, las citocinas se detectan mediante un ensayo inmunológico (ELISA) que utiliza anticuerpos específicos y una reacción enzimática de color.

Nota: A partir de julio de 2025, la Comisión de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) recomienda utilizar la prueba de activación de monocitos (MAT) como método preferido para la detección de pirógenos. La prueba de pirógenos en conejos (RPT) está ahora prohibida en Europa.

Lea el artículo y coméntelo con nuestros expertos para pasar a la MAT, que detecta pirógenos endotóxicos y no endotóxicos, y seguir la tendencia normativa.

Prueba de endotoxinas bacterianas (prueba LAL)

El método más común para la prueba de endotoxinas es la prueba del lisado de amebocitos de Limulus (prueba LAL), un ensayo basado en el lisado de amebocitos de la sangre del cangrejo herradura. El lisado de las células sanguíneas del cangrejo herradura reacciona de forma natural con las endotoxinas bacterianas en una reacción de coagulación. Este método tiene una alta sensibilidad para la cuantificación de endotoxinas, pero no detecta pirogénios no endotóxicos.

Prueba del factor C recombinante (rFC)

El factor C recombinante es una proteína modificada genéticamente que se encuentra normalmente en la cascada del lisado de amebocitos de Limulus. En esta prueba, el factor C reacciona con la endotoxina y se une a un marcador para producir un producto final fluorescente cuantificable. La prueba del factor C recombinante utiliza el mismo principio que la prueba LAL, pero sin necesidad de material de origen animal.