Ensayos de actividad enzimática
Figura 1.Representación del proceso de ensayo de la actividad enzimática que comienza con un donante de fluorescencia y un aceptor de extinción en un sustrato que pasa por una escisión enzimática para eliminar el extintor, mostrando un aumento de la actividad fluorescente que indica que se está produciendo actividad enzimática.
Los ensayos de actividad enzimática son realizados principalmente por investigadores para identificar la presencia o la cantidad de una enzima específica en un organismo, tejido o muestra. Entre los ejemplos de estas enzimas se incluyen la α-amilasa, la catalasa, la lacasa, la peroxidasa, la lisozima y las enzimas reporteras fosfatasa alcalina y luciferasa. Existen diversos reactivos y metodologías que permiten investigar las interacciones específicas entre enzimas y sustratos. La selección de una solución de flujo de trabajo adecuada depende de la sensibilidad que requiera el investigador. Las soluciones colorimétricas son útiles para la detección, mientras que los reactivos basados en fluorescencia son más adecuados para la cuantificación de la actividad enzimática.
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Determinación de las condiciones óptimas para la actividad enzimática
Aunque en la bibliografía se han descrito numerosos ensayos enzimáticos, es necesario modificar estos procedimientos para adaptarlos a los requisitos específicos de la enzima que se está investigando. La actividad específica de una enzima depende de numerosos factores, entre los que se incluyen el pH, la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de todos los componentes del ensayo. En condiciones como el pH, la actividad enzimática suele seguir una curva en forma de campana. La actividad más alta en un pH específico se denominaVmax, y se observa una disminución de la actividad en ambos extremos de la curva. Algunas enzimas pueden requerir consideraciones adicionales para compuestos que no participan directamente en la reacción, como ionenes metálicos, detergentes y moléculas hidrofóbicas.
Determinación de las condiciones óptimas para la actividad enzimática
Aunque en la literatura se han descrito numerosos ensayos enzimáticos, es necesario modificar estos procedimientos para adaptarlos a los requisitos específicos de la enzima que se está investigando. La actividad específica de una enzima depende de numerosos factores, entre los que se incluyen el pH, la temperatura, la fuerza iónica y la concentración de todos los componentes del ensayo. En condiciones como el pH, la actividad enzimática suele seguir una curva en forma de campana. La actividad más alta a un pH específico se denominaVmax, y se observa una disminución de la actividad en ambos extremos de la curva. Algunas enzimas pueden requerir consideraciones adicionales para compuestos que no participan directamente en la reacción, como ionenes metálicos, detergentes y moléculas hidrofóbicas.
Componentes del ensayo enzimático
Para muchas enzimas, el agua es el disolvente estándar, ya que es el mismo entorno acuoso que se encuentra en las células. Sin embargo, en algunos casos se utilizan disolventes orgánicos cuando las enzimas o los componentes enzimáticos son insolubles en agua. Además, los sustratos y cofactores, catalizadores de las reacciones enzimáticas, también son componentes críticos en un ensayo de actividad enzimática. Los sustratos y cofactores se identifican a menudo en función de sus funciones en condiciones fisiológicas. Como tales, los sustratos y cofactores interactúan ampliamente y pueden ser necesarios para una amplia gama de enzimas. Los tampones y los iones son elementos críticos adicionales a tener en cuenta, ya que son esenciales para estabilizar el pH durante todo el ensayo e influyen directamente en la actividad enzimática. Por ejemplo, los iones metálicos mono o divalentes pueden ser necesarios para la actividad catalítica de los cofactores en la reacción y son esenciales para la actividad enzimática.
Realización de un ensayo enzimático
La preparación de los componentes del ensayo enzimático es un primer paso práctico. Por lo general, es ventajoso preparar una mezcla de ensayo grande, excluyendo un componente activador, para evitar el error de pipeteo que es inherente al pipeteo de pequeños volúmenes. Una vez preparada la mezcla de ensayo, los investigadores añadirán el componente activador final a la mezcla para iniciar el ensayo de actividad. El pretratamiento de la enzima mediante su almacenamiento a temperaturas frescas y, a menudo, la inclusión de diversos aditivos químicos o proteicos son factores críticos para garantizar la estabilidad de la enzima y su máxima actividad antes del inicio del ensayo. Una vez que los materiales de reacción se combinan en un recipiente de observación, todos los componentes deben mezclarse rápida y completamente al comenzar la reacción. El registro de datos debe comenzar inmediatamente después de la mezcla, y la señal detectable del ensayo debe representarse gráficamente durante todo el transcurso de la reacción.
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