小分子高效液相色谱

小分
子的HPLC分析

小分子的高效液相色谱分析通常采用反相分离模式。对于极性化合物的分离，亲水相互作用色谱（HILIC）和正相色谱同样适用，其中HILIC是首选方法。对于离子化合物的分离，可采用离子交换分离模式；对于无机阴离子或阳离子，也可使用离子色谱法。

HPLC色谱柱的固定相可填充全多孔二氧化硅颗粒、表面多孔二氧化硅颗粒、聚合物颗粒，或由整体式二氧化硅棒构成。此外，还使用氧化铝、氧化锆颗粒和碳颗粒。用于小分子分离的固定相材料的典型孔径范围为60 Å至160 Å。 对于HPLC，固定相的典型粒径范围为3 µm至5 µm；而UHPLC则使用更小的粒径，通常为2 µm或以下。可在固定相上引入不同的柱选择性（修饰）。C18烷基链是反相（RP）色谱中最常用的柱化学修饰。 此外，其他修饰基团（如C30、C8、苯基、五氟苯基）以及各种极性更强的修饰基团，还有具有离子交换或手性特性的修饰基团，均可实现几乎所有可溶于液体的化合物的分离。反相高效液相色谱（RP-HPLC）的流动相通常由水溶液缓冲液或水，以及乙腈或甲醇等与水混溶的有机溶剂组成。

高效液相色谱（HPLC）样品制备

复杂且基质丰富的样品，如食品、饮料、化妆品、生物样品以及基质丰富的药物制剂（例如乳膏、糖浆），需要高效的样品制备方案来去除不需要的组分，并选择性地提取目标分析物。对于采用超高效液相色谱（UHPLC）且使用2 µm或以下极小粒径固定相的情况，这一点尤为关键。 常见的样品制备方法包括液-液萃取、固相萃取（SPE），对于生物样品，除过滤外还包括蛋白质沉淀。 除了选择性洗脱目标化合物和预浓缩外，样品制备的主要目的是保护HPLC固定相免受样品基质引起的堵塞。基于整体硅胶的HPLC色谱柱对基质的耐受性极高，所需的样品制备步骤远少于颗粒型色谱柱。 

衍生化

对于某些分子，需要在HPLC分离之前（柱前）或之后（柱后）进行衍生化处理。衍生化将分子转化为其衍生物，以提高HPLC中的灵敏度或色谱保留效果。为此，会使用具有所需物理和化学性质的化学试剂进行必要的衍生化处理。