qPCR
La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utiliza moléculas marcadoras fluorescentes que permiten cuantificar los productos amplificados. Al igual que en la PCR convencional, se amplifica una molde de ADN, ADNc o ARN, pero en cada ciclo se monitorizan las señales fluorescentes para realizar una cuantificación relativa o absoluta.
Esta técnica resulta útil en numerosas áreas de investigación, entre las que se incluyen el análisis de la expresión génica, el genotipado, el análisis de microARN, el análisis de la variación genética y el análisis de proteínas.
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un pilar fundamental en los laboratorios de biología molecular. La PCR se utiliza para amplificar el ADN en varios órdenes de magnitud, y nuestros reactivos y recursos son adecuados para numerosos flujos de trabajo de investigación, entre los que se incluyen el análisis de la expresión génica, el genotipado, la secuenciación y las aplicaciones de mutagénesis.
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Cómo analizar datos de qPCR
Se mide y cuantifica la fluorescencia de las moléculas indicadoras; normalmente se trata de colorantes (por ejemplo, SYBR® Green o bromuro de etidio) que se intercalan entre las bases del ADN bicatenario, o de sondas diseñadas para unirse a una secuencia específica (por ejemplo, balizas moleculares o sondas TaqMan®) del ADN.
Cuantificación relativa de los datos de qPCR
Existen dos métodos principales de cuantificación de los datos de qPCR. La cuantificación relativa, el método más habitual, utiliza la información ΔΔCt, mediante la cual se determina la relación de expresión o abundancia del gen diana en la muestra, en comparación con un gen de control, y se normaliza con la relación de expresión de un gen de referencia. Dado que los valores de eficiencia E para los genes diana y de referencia difieren, este método también tiene en cuenta las diferencias en los valores de E. Este método se emplea con mayor frecuencia en el análisis de la expresión génica.
Cuantificación absoluta de datos de qPCR
El segundo método, la cuantificación absoluta, es más habitual en microbiología ambiental y utiliza la curva estándar (SC). El método de la SC utiliza series de diluciones de una concentración conocida de molde, N0, para crear una curva estándar mediante la regresión lineal de log(N0) frente al CT (ciclo umbral). A continuación, esto se utiliza para calcular las concentraciones de molde de la muestra. La base de este método es que el valor de eficiencia de la muestra es el mismo que el del patrón.
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