Anti-fosfo-ubiquitina (Ser65)

Evaluada mediante inmunotransferencia Western en células HeLa que expresan PINK1.

Análisis mediante inmunoelectrotransferencia (western blot): Una dilución 1:1 000 de este anticuerpo detectó inducción de fosforilación de la Ser65 de la ubiquitina celular en 10 µg de lisado de células HeLa que expresan PINK1 en tratamiento con CCCP (Nº de ref. 215911).

Análisis mediante inmunocitoquímica: una dilución 1:500 de un lote representativo detectó la fosforilación de la Ser65 de la ubiquitina inducida por el tratamiento con CCCP (Nº de ref. 215911) en células HeLa que expresan PINK1.

Análisis mediante inmunoelectrotransferencia (WB): Una dilución 1:5 000 de un lote representativo detectó fosforilación de la Ser65 catalizada por GST-PINK1 de una ubiquitina recombinante.

Análisis inmunocitoquímico: Una dilución 1:200 de un lote representativo detectó fosfoubiquitina (Ser65) en células HeLa que expresaban PINK1 tratadas con CCCP y sin tratar. (Cortesía del Dr. Noriyuki Matsuda).

Detección de la fosforilación de la Ser65 de la ubiquitina utilizando este anticuerpo policlonal de conejo anti-fosfo-Ubiqutina (Ser65), Nº ref. ABS1513-I, validado para utilizar en inmunocitoquímica e inmunotransferencia Western.

Este anticuerpo policlonal detecta sólo la ubiquitina fosforilada en la Ser65 (Ub) y proteínas ubiquitinadas (incluyendo las oligoUb y las poliUb) que contienen ubiquitina fosforilada en laSer65. No hay reactividad con la Ub ni las proteínas ubiquitinadas en ausencia de fosforilación de la Ser65 de la Ub.

Se prevé que reaccione con una amplia gama de especies debido a la homología de secuencia del 100 %.

La ubiqutina (Ub) se produce inicialmente como una proteína precursora de 229 a.a., la poliubiquitina B (UniProt P0CG47) codificada por el gen UBB (ID del gen 7314) o una proteína precursora de 685 a.a., la poliubiquitina C (UniProt P0CG48) codificada por el gen UBC (ID del gen 7316) en humanos. Los C-terminales de la poliubiquitina-B (Cys229) y la poliubiquitina-C (Val685) se eliminan después de la traducción, seguido de otras escisiones postraduccionales para producir múltiples copias de moléculas idénticas de ubiquitina de 76 aminoácidos (también conocida como proteína no histona de grupo de alta movilidad HMG-20) (tres copias por la poliubiquitina-B y nueve por la poliubiquitina-C). Las modificaciones covalentes de las proteínas diana a través de diferentes residuos Lys de la Ub son eventos bien documentados durante la reparación del ADN celular, la degradación asociada al retículo endoplásmico (ERAD), la activación de la transcripción y la degradación lisosómica y proteasómica. La PINK1 (cinasa 1 putativa inducida por PTEN) es una Ser/Thr cinasa que se acumula específicamente en mitocondrias despolarizadas, donde actúa como un regulador positivo de la actividad E3 ubiquitina (Ub) ligasa parkina (Park2) al fosforilar la Ub en la Ser65 así como el correspondiente resto de Ser en el dominio tipo Ub (UBL) N-terminal de la parkina. La Ub fosforilada interactúa con la parkina fosforilada en su dominio GINGO0 de una manera alostérica, induciendo un cambio de conformación y exponiendo la cisteína catalítica del dominio RING2 de la parkina para una actividad ligasa completa. Un estudio de conformación mediante NMR revela que la Ub fosforilada en la Ser65 existe en dos conformaciones en disolución. La conformación principal muestra propiedades superficiales alteradas, mientras que la segunda conformación de fosfoUb exhibe una cola C terminal retraída por dos residuos en el centro de la Ub. La fosforilación de la Ser65 de la Ub tiene poco efecto en la carga de E2 mediada por E1 y afecta principalmente a la descarga de enzimas E2 para formar cadenas de poliUb. Además, se ha demostrado que la mayoría de las desubiquitinasas (Dub), incluidas USP8, USP15 y USP30, presentan una actividad deteriorada contra la poli-fosfoUb ligada a la Lys63.

~17/8 y ~45-250 kDa observados. 8,565/17,112/25,66/34,21 kDa (mono/di/tri-tetra-ubiquitina) calculados. Las bandas de ~45-250 kDa representan proteínas ubiquitinadas que contienen Ub ser65-fosforilada. Pueden observarse bandas no caracterizadas en algunos lisados.

Péptido lineal conjugado con KLH que corresponde a la secuencia de la región específica de la ubiquitina que contiene la Ser65 fosforilada.

Sustituye a: ABS1513