qPCR
La PCR quantitative en temps réel (qPCR) utilise des molécules rapporteuses fluorescentes pour permettre la quantification des produits amplifiés. Comme dans la PCR classique, une matrice d'ADN, d'ADNc ou d'ARN est amplifiée, mais à chaque cycle, les signaux fluorescents sont surveillés afin de procéder à une quantification relative ou absolue.
Cette technique est utile dans de nombreux domaines de recherche, notamment l'analyse de l'expression génique, le génotypage, l'analyse des microARN, l'analyse des variations génétiques et l'analyse des protéines.
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La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un pilier des laboratoires de biologie moléculaire. La PCR permet d'amplifier l'ADN de plusieurs ordres de grandeur, et nos réactifs et ressources sont adaptés à de nombreux protocoles de recherche, notamment l'analyse de l'expression génique, le génotypage, le séquençage et les applications de mutagenèse.
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Comment analyser les données de qPCR
La fluorescence des molécules rapporteuses est mesurée et quantifiée ; il s’agit généralement soit de colorants (par exemple, SYBR® Green, bromure d’éthidium) qui s’intercalent entre les bases de l’ADN double brin, soit de sondes conçues pour se lier à une séquence spécifique (par exemple, les balises moléculaires, les sondes TaqMan®) sur l’ADN.
Quantification relative des données de qPCR
Il existe deux grandes méthodes de quantification des données de qPCR. La quantification relative, qui est la méthode la plus courante, utilise les informations ΔΔCt, grâce auxquelles le rapport d’expression ou d’abondance du gène cible dans l’échantillon est déterminé par rapport à un gène témoin, puis normalisé par rapport au rapport d’expression d’un gène de référence. Étant donné que les valeurs d’efficacité E diffèrent entre le gène cible et le gène de référence, cette méthode tient également compte de ces différences. Cette méthode est plus fréquemment utilisée dans l’analyse de l’expression génique.
Quantification absolue des données de qPCR
La deuxième méthode, la quantification absolue, est plus courante en microbiologie environnementale et utilise la courbe étalon (SC). La méthode de la courbe étalon utilise une série de dilutions d’une concentration connue en matrice, N0, pour établir une courbe étalon à partir de la régression linéaire entre log(N0) et le CT (cycle seuil). Celle-ci sert ensuite à calculer les concentrations en matrice de l’échantillon. Cette méthode repose sur l’hypothèse que la valeur d’efficacité de l’échantillon est identique à celle de l’étalon.
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