Agua para el cultivo de células de mamíferos
El cultivo de células de mamíferos es esencial para la investigación moderna en ciencias de la vida y la biofabricación. Estas células desempeñan un papel fundamental en la investigación biológica, el descubrimiento de fármacos, el desarrollo de vacunas y la producción de productos biofarmacéuticos. Al imitar las condiciones fisiológicas in vitro, las células de mamíferos permiten a los científicos estudiar el comportamiento celular, evaluar nuevos tratamientos y producir productos biológicos de forma segura y eficiente. Para obtener resultados fiables y reproducibles se requieren condiciones de cultivo óptimas, lo que incluye técnicas asépticas y el uso de agua purificada de alta calidad.
Resumen de la sección
- Tipos de cultivo celular: células primarias y líneas celulares inmortalizadas
- Aplicaciones del cultivo celular
- Componentes de los medios de cultivo celular
- Repercusión de la calidad del agua en el cultivo celular
- Efecto de los contaminantes del agua en el cultivo celular y tisular
- Estudio: Efecto del agua ultrapura ultrafiltrada en el cultivo de tejidos
- Ultrafiltración para la eliminación de endotoxinas del agua
- Agua libre de endotoxinas para el cultivo celular
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Tipos de cultivos celulares: células primarias y líneas celulares inmortalizadas
El cultivo celular es una técnica de laboratorio de uso común mediante la cual se cultivan células procariotas o eucariotas en condiciones controladas. Las células suelen aislarse a partir de tejido (células primarias) o de una línea celular inmortalizada ya establecida (células secundarias). Las células primarias tienen una vida útil limitada, salvo que procedan de tejido tumoral, mientras que las líneas celulares inmortalizadas pueden proliferar indefinidamente. También es posible fusionar células primarias con una línea celular inmortalizada para producir hibridomas, una técnica utilizada para producir anticuerpos monoclonales. La simulación de los entornos complejos de las células y tejidos primarios y secundarios requiere medios de cultivo especializados.
Aplicaciones del cultivo celular
El cultivo de células de mamíferos a gran escala se utiliza ampliamente en biotecnología para producir vacunas, proteínas, enzimas, anticuerpos y hormonas. El cultivo celular también se emplea en muchos campos de investigación, incluido el desarrollo farmacéutico, donde las células se utilizan como modelos para estudiar enfermedades como el cáncer o las cardiopatías. Las células cultivadas se utilizan en el análisis genómico, la identificación y validación de dianas, los ensayos basados en células para el cribado de alto rendimiento (HTS), los ensayos de permeabilidad y para producir proteínas terapéuticas. Los sistemas modernos de cultivo celular incluyen el análisis de células vivas, el cultivo celular en 3D y los cultivos de tejidos complejos para modelar las funciones de los órganos. Estos sistemas de cultivo celular pueden utilizar microfluídica para cultivar células individuales¹ o biorreactores de gran volumen para cultivar millones de células destinadas a diversas aplicaciones, como la producción de proteínas recombinantes, terapias con células madre e incluso carne «cultivada» en laboratorio².
Componentes de los medios de cultivo celular
Las células cultivadas se desarrollan en medios de crecimiento específicos, ya sea en suspensión o como cultivos adherentes (monocapa). Los medios de cultivo celular suelen contener aminoácidos, glucosa, vitaminas, sales inorgánicas y lípidos, y pueden contener suero animal, factores de crecimiento, hormonas, antibióticos, antioxidantes y otros componentes. Entre los tipos de medios se incluyen los basados en suero, sin suero, sin componentes de origen animal, sin proteínas y químicamente definidos. Para que las células se mantengan sanas y sigan creciendo, deben disponer de nutrientes suficientes; por lo tanto, los medios deben reponerse periódicamente. Además, cuando las líneas celulares adherentes alcanzan la confluencia (cubren toda la superficie disponible), es necesario realizar un subcultivo para que sigan creciendo. Cualquier preparación o cambio de los medios de cultivo supone un riesgo de contaminación que puede afectar a los resultados experimentales o destruir las reservas de células.
Impacto de la calidad del agua en el cultivo celular
Hay que tener mucho cuidado para evitar cualquier riesgo de contaminación celular. La contaminación puede alterar el crecimiento y las características de las células, y trabajar sin saberlo con células contaminadas puede dar lugar a resultados inexactos o erróneos.
El agua se utiliza en muchas etapas del proceso de cultivo de tejidos o células. Es el componente principal de los tampones y los medios de cultivo, se emplea para la disolución de aditivos y fármacos, y para el enjuague de biorreactores, material de plástico y de vidrio. Además, el agua se utiliza en muchos instrumentos relacionados con el trabajo de cultivo celular, como autoclaves e incubadoras. Por lo tanto, la calidad del agua puede desempeñar un papel importante en los resultados experimentales del cultivo celular.
La contaminación puede ser biológica (bacterias, mohos, levaduras, micoplasmas, virus, protozoos, etc.) o química (debida a la contaminación de los nutrientes, el agua o los aditivos utilizados para preparar los medios, o del material de plástico empleado).
La contaminación del cultivo celular por bacterias, levaduras o mohos es siempre motivo de preocupación y los científicos hacen todo lo posible por evitarla. Estas contaminaciones suelen ser visibles a simple vista o con un microscopio óptico. La contaminación por sustancias químicas también puede afectar al crecimiento, la morfología o el comportamiento de las células cultivadas, aunque sea indetectable a simple vista.
Impacto de los contaminantes del agua en el cultivo celular y tisular
Algunos compuestos presentes de forma natural en el agua que pueden afectar al cultivo de células de mamíferos son:
Bacterias
La contaminación bacteriana puede provocar cambios repentinos en el pH de los medios de cultivo y contaminar los cultivos puros. Las bacterias pueden producir toxinas que alteran el crecimiento y la función celular, la eficiencia de la clonación y la producción de proteínas recombinantes.
Endotoxinas
Las endotoxinas son lipopolisacáridos (LPS) procedentes de las paredes de las bacterias Gram-negativas. Son el tipo más común de pirógenos. Los macrófagos y los fagocitos mononucleares liberan diversas citocinas proinflamatorias en respuesta a la estimulación por endotoxinas. Se sabe que los LPS generan efectos tóxicos tempranos, como radicales libres altamente dañinos, y acciones tóxicas lentas, como la disfunción celular, la apoptosis y la necrosis. Para los cultivos de células de mamíferos se requiere agua libre de endotoxinas.
Iones inorgánicos
Se ha demostrado que los metales pesados, como el mercurio, el plomo, el zinc, el níquel, el cromo y el cadmio, son tóxicos para diversas células, incluidas las gliales y las neuronales.
Compuestos orgánicos
En el agua natural suelen estar presentes pequeñas moléculas orgánicas (ácidos húmicos, taninos, pesticidas, disruptores endocrinos, etc.) que pueden permanecer en el agua del grifo. Se sabe que estas sustancias afectan al desarrollo celular y, por lo tanto, deben eliminarse mediante procesos adecuados durante la producción de agua de grado de laboratorio.
Estudio: Efecto del agua ultrapura ultrafiltrada en el cultivo de tejidos
Se aislaron cardiomiocitos a partir de tejido cardíaco de rata adulta. Se lavaron en un tampón a base de HEPES, se suspendieron en medio mínimo esencial (MEM) y se sembraron en placas recubiertas de laminina. Se utilizó agua ultrapura para preparar los tampones destinados al procedimiento de extracción y al cultivo.
Se utilizaron dos tipos de agua: agua ultrapura recién purificada y ultrafiltrada (Agua A), y agua ultrapura almacenada antes de su uso y no tratada con ultrafiltración (Agua B). Se estudió el efecto de la calidad del agua sobre la viabilidad de los cardiomiocitos.
Cuando los tampones se prepararon con agua ultrapura recién purificada y ultrafiltrada (Agua A), se obtuvieron muchos cardiomiocitos viables, como lo demuestra su forma alargada y estriada (Figura 1A). Sin embargo, cuando se utilizó agua ultrapura almacenada antes de su uso y no tratada con ultrafiltración (Agua B), se obtuvieron pocas células viables (Figura 1B).
Figura 1Fotomicrografías de cardiomiocitos aislados preparados con agua A (A) o agua B (B). Imágenes cedidas por los doctores C. Plin y R. Zini, INSERM U660, Facultad de Medicina de Créteil, Francia.
Durante el almacenamiento de agua ultrapura en un recipiente de plástico tipo garrafón, es probable que se desarrollen bacterias que liberen endotoxinas. En este estudio, la concentración de bacterias en el Agua B fue de aproximadamente 4.000 ufc/ml y la concentración de endotoxinas fue de 8 EU/ml. Los niveles de endotoxinas presentes en el Agua B eran lo suficientemente altos como para tener un efecto perjudicial sobre los cardiomiocitos durante el proceso de aislamiento.
En conclusión, se recomienda el uso de agua ultrapura para el cultivo de células y tejidos. El uso de agua ultrapura recién purificada y la instalación de un cartucho de ultrafiltración (purificador Biopak®) en el punto de uso del sistema de purificación de agua eliminan el riesgo de contaminación por endotoxinas, lo que puede tener un efecto importante en los resultados del cultivo de células y tejidos.
Ultrafiltración para la eliminación de endotoxinas del agua
Las endotoxinas (o LPS) son moléculas tóxicas liberadas por las bacterias. Pueden afectar al crecimiento, al funcionamiento y a la eficiencia de clonación de muchos tipos de células, por lo que suponen un motivo de preocupación para los investigadores que trabajan con células.
Dado que el LPS está formado por un grupo lipídico muy hidrofóbico (lípido A) unido covalentemente a una larga y compleja cola de polisacáridos, tiende a formar grandes agregados en solución acuosa. La ultrafiltración es una tecnología basada en membranas que elimina las endotoxinas mediante un proceso de filtración.
Los datos que se muestran en la figura 2 demuestran la eficacia de la eliminación de endotoxinas mediante un ultrafiltro. El depurador Biopak® es un dispositivo de ultrafiltración que elimina de forma fiable incluso grandes cargas de endotoxinas. El ultrafiltro se coloca a la salida del sistema de purificación de agua. El agua suministrada está libre de endotoxinas y de bacterias, y no requiere esterilización en autoclave.
Figura 2Demostración de la eliminación de endotoxinas mediante un ultrafiltro (purificador Biopak®).
Agua libre de endotoxinas para cultivo celular
En conclusión, el agua ultrapura (Tipo 1) (con una resistividad de 18,2 MΩ•cm y un bajo nivel de TOC), purificada con un cartucho de ultrafiltración, como el pulidor Biopak®, es adecuada para preparar medios de cultivo celular. Está libre de bacterias y endotoxinas, así como de contaminación química. La ultrafiltración es una forma eficaz y sencilla de obtener agua libre de bacterias y endotoxinas según las necesidades. No es necesario esterilizar el agua en autoclave. El agua ultrapura purificada mediante ultrafiltración puede utilizarse con total seguridad para el cultivo celular, incluido el cultivo de células madre.
Existe una gama de soluciones de purificación de agua adaptadas a las necesidades de los científicos que trabajan con todo tipo de cultivos celulares.