HPLC pour petites molécules
Analyse des petites molécules
Une petite molécule désigne un composé de faible poids moléculaire (généralement inférieur à 900 daltons). Parmi les exemples courants de petites molécules, on peut citer les acides aminés, les lipides, les sucres, les acides gras, les alcaloïdes et bien d’autres encore.
Différentes méthodes permettent de séparer les petites molécules, notamment la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), la chromatographie liquide (CL), la chromatographie en phase gazeuse (CPG), la chromatographie sur couche mince (CCM) et l’électrophorèse capillaire (EC). Par ailleurs, les techniques d’identification comprennent la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) ou la spectrométrie de masse (MS). La chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) est devenue ces dernières années une technique incontournable pour l’identification des petites molécules.
Pour obtenir les meilleurs résultats possibles lors d'analyses par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), UHPLC ou LC-MS de petites molécules, il est essentiel de choisir la phase stationnaire et les conditions de la phase mobile les mieux adaptées. La composition chimique de l'analyte est déterminante pour sélectionner la composition chimique de colonne la plus appropriée. D'autres facteurs, tels que la vitesse, la matrice de l'échantillon et le nombre de composés, permettent de définir le matériau de base le plus adapté pour la phase stationnaire.
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HPLC des petites molécules
L'analyse par HPLC des petites molécules est le plus souvent réalisée en mode de séparation en phase inverse. Pour la séparation des composés polaires, la chromatographie par interaction hydrophile (HILIC) et la chromatographie en phase normale conviennent également, la HILIC étant la méthode privilégiée. Pour la séparation des composés ioniques, on peut également recourir à des modes de séparation par échange d'ions, ainsi qu'à la chromatographie ionique pour les anions ou cations inorganiques.
La colonne HPLC est garnie soit de particules de silice entièrement poreuses, soit de particules de silice à porosité superficielle, soit de particules polymères, soit d’une tige de silice monolithique servant de phase stationnaire. On utilise également de l’oxyde d’alumine, des particules de zircone et des particules de carbone. La taille de pore typique du matériau de la phase stationnaire pour la séparation des petites molécules se situe entre 60 Å et 160 Å. Pour la HPLC, la taille typique des particules de la phase stationnaire varie de 3 µm à 5 µm ; pour l’UHPLC, on utilise des particules plus petites, généralement de 2 µm ou moins. Différentes sélectivités de colonne (modifications) peuvent être associées à la phase stationnaire. Une chaîne alkyle C18 est la chimie de colonne la plus couramment utilisée en chromatographie en phase inverse (RP). Néanmoins, d’autres modifications, telles que C30, C8, phényle, pentafluorophényle et une large gamme de modifications plus polaires, ainsi que des modifications présentant des propriétés d’échange d’ions ou chirales, permettent la séparation de presque tous les composés solubles dans les liquides. La phase mobile pour la HPLC en phase inverse (RP) se compose généralement d’un tampon aqueux ou d’eau et de solvants organiques miscibles à l’eau, tels que l’acétonitrile ou le méthanol.
Préparation des échantillons
pour la HPLC
Les échantillons complexes et riches en matrice, tels que les aliments, les boissons, les cosmétiques, les échantillons biologiques et les formulations pharmaceutiques riches en matrice (par exemple, les crèmes ou les sirops), nécessitent des protocoles de préparation d’échantillons efficaces afin d’éliminer les composants indésirables et d’extraire de manière sélective l’analyte d’intérêt. Cela est essentiel lorsqu’on utilise une phase stationnaire composée de particules de très petite taille, comme en UHPLC, où l’on utilise des particules de 2 µm ou moins. Les méthodes courantes de préparation des échantillons sont l’extraction liquide-liquide, l’extraction en phase solide (SPE) et, pour les échantillons biologiques, la précipitation des protéines en plus de la filtration. Outre l’élution sélective du composé cible et la préconcentration, l’objectif principal de la préparation des échantillons est de protéger la phase stationnaire de la HPLC contre le colmatage causé par la matrice de l’échantillon. Les colonnes HPLC à base de silice monolithique tolèrent très bien la présence de matrice et nécessitent une préparation des échantillons bien moindre que les colonnes à particules.
Dérivatisation
Pour certaines molécules, une dérivatisation est nécessaire, soit avant (pré-colonne), soit après (post-colonne) la séparation par HPLC. La dérivatisation transforme les molécules en leurs dérivés afin d’améliorer la sensibilité ou la rétention chromatographique en HPLC. Des réactifs chimiques, présentant les propriétés physiques et chimiques souhaitées, sont utilisés pour la dérivatisation requise.
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