HPLC pour petites molécules

HPLC des petites molécules

L'analyse HPLC des petites molécules est le plus souvent réalisée en mode de séparation en phase inversée. Pour la séparation des composés polaires, la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et la chromatographie en phase normale conviennent également, la HILIC étant la méthode préférée. Pour la séparation des composés ioniques, les modes de séparation par échange d'ions et, pour les anions ou cations inorganiques, la chromatographie ionique peuvent également être utilisés.

La colonne CLHP est remplie de particules de silice entièrement poreuses, de particules de silice superficiellement poreuses, de particules polymères ou est constituée d'une barre de silice monolithique comme phase stationnaire. En outre, des particules d'oxyde d'alumine, de zircone et de carbone sont utilisées. La taille typique des pores de la phase stationnaire pour la séparation des petites molécules est comprise entre 60 Å et 160 Å. Pour la CLHP, la taille typique des particules de la phase stationnaire est comprise entre 3 et 5 µm, tandis que pour la CLHP, on utilise des particules de plus petite taille, généralement de 2 µm ou moins. Différentes sélectivités de colonne (modifications) peuvent être attachées à la phase stationnaire. Une chaîne alkyle C18 est la chimie de colonne la plus couramment utilisée dans la chromatographie en phase inversée (RP). Néanmoins, d'autres modifications, telles que C30, C8, Phényle, Pentaflourophényle et une large gamme de modifications plus polaires ainsi que des modifications avec des propriétés d'échange d'ions ou chirales permettent la séparation de presque tous les composés solubles dans les liquides. La phase mobile pour la CLHP-PR se compose généralement d'un tampon aqueux ou d'eau et de solvants organiques miscibles à l'eau comme l'acétonitrile ou le méthanol.

Préparation d'échantillons CLHP

Les échantillons complexes et riches en matrice, tels que les aliments, les boissons, les cosmétiques, les échantillons biologiques et les formulations pharmaceutiques riches en matrice (par exemple, crème, sirop) nécessitent des protocoles de préparation d'échantillons efficaces afin d'éliminer les composants indésirables et d'extraire sélectivement l'analyte d'intérêt. Ceci est critique si une phase stationnaire avec des particules de très petite taille est utilisée comme dans l'UHPLC, où des particules de 2 µm ou moins sont utilisées. Les méthodes courantes de préparation des échantillons sont l'extraction liquide-liquide, l'extraction en phase solide (SPE) et, pour les échantillons biologiques, la précipitation des protéines en plus de la filtration. Outre l'élution sélective du composé cible et la préconcentration, le principal objectif de la préparation de l'échantillon est de protéger la phase stationnaire de la CLHP contre le colmatage causé par la matrice de l'échantillon. Les colonnes CLHP basées sur silice monolithique peut tolérer la matrice dans une large mesure et nécessite beaucoup moins de préparation d'échantillon que les colonnes particulaires. 

Dérivatisation

Pour certaines molécules, une dérivatisation est nécessaire, soit avant (pré-colonne), soit après (post-colonne) la séparation HPLC. La dérivatisation convertit les molécules en leurs dérivés afin d'améliorer la sensibilité ou la rétention chromatographique dans la CLHP. Des réactifs chimiques, dotés de propriétés physiques et chimiques souhaitables, sont utilisés pour la dérivatisation requise.