Lyse et extraction des protéines

Il existe de nombreuses méthodes pour rompre les cellules et préparer leur contenu en vue d'une analyse. En général, on utilise des méthodes douces lorsque l'échantillon est constitué de cellules cultivées ou de cellules sanguines facilement lysables, tandis que des méthodes plus vigoureuses sont utilisées pour rompre les cellules bactériennes ou végétales plus robustes, ou les cellules mammifères enfouies dans le tissu conjonctif.

• Lyse à base de détergent: La lyse à base de détergent est une méthode douce qui peut être utilisée pour les cellules mammifères, les cellules bactériennes, les levures et les plantes. Les suspensions cellulaires sont centrifugées doucement et remises en suspension dans une solution de lyse contenant des détergents qui agissent pour perturber la membrane cellulaire. Les membranes sont solubilisées, lysant les cellules et libérant leur contenu. Les détergents peuvent devoir être éliminés en aval s'ils interfèrent avec l'analyse ou la production.
• Lyse par congélation-décongélation :  Cette méthode est applicable aux suspensions de cellules mammifères ou bactériennes. La suspension cellulaire est rapidement congelée à l'aide d'azote liquide. L'échantillon est ensuite décongelé et remis en suspension par pipetage ou vortexage doux dans un tampon de lyse, en répétant le processus plusieurs fois. Entre les cycles, l'échantillon est centrifugé et le surnageant contenant les protéines solubles est conservé.
• Choc osmotique: il s'agit d'une méthode très douce qui peut suffire à la lyse des cellules mammifères ou bactériennes en suspension sans utiliser de détergent. Cette méthode, souvent associée à une disruption mécanique, repose sur le passage d'un milieu osmotique élevé à un milieu osmotique faible, et convient particulièrement aux applications dans lesquelles le lysat doit ensuite être fractionné en composants subcellulaires.
• Ultrasonification: cette méthode d'extraction des protéines est le plus souvent appliquée aux suspensions cellulaires. Les cellules sont perturbées par des ondes sonores à haute fréquence via une sonde insérée dans l'échantillon. Les ondes sonores génèrent une zone de basse pression, provoquant la perturbation des membranes cellulaires.
• Méthodes mécaniques: les protéines peuvent être extraites des cellules et des tissus à l'aide de diverses mesures « d'écrasement et de broyage » rudimentaires mais efficaces. Par exemple, les membranes cellulaires peuvent être désagrégées par des forces de cisaillement liquides à l'aide d'une homogénéisation Dounce ou Potter-Elvehjem. Les tissus peuvent être homogénéisés par hachage ou broyage dans un tampon refroidi à l'aide d'un mélangeur Waring ou d'un homogénéisateur Polytron®. Les tissus ou les cellules peuvent être congelés dans de l'azote liquide et broyés en une poudre fine à l'aide d'un mortier et d'un pilon avec de l'alumine ou du sable. L'agitation rapide des cellules avec des billes de verre fines détruit les parois cellulaires, ce qui est efficace pour la plupart des bactéries Gram positives et Gram négatives.
• Digestion enzymatique: Les méthodes enzymatiques sont fréquemment utilisées pour extraire les protéines des bactéries, des levures ou des cellules eucaryotes enfouies dans des tissus fibreux où les membranes cellulaires sont entourées d'une structure protectrice robuste. Les enzymes ou cocktails de lyse cellulaire tels que le lysozyme, la mutanolysine, la métapolyzyme, la lysonase et la pronase peuvent être utilisés en combinaison avec des enzymes de digestion tissulaire (c'est-à-dire la collagénase, la chondroïtinase, l'hyaluronidase) pour dissoudre ou détruire les parois cellulaires, les enveloppes, les capsules, les capside ou d'autres structures difficiles à couper par des méthodes mécaniques seules. La digestion enzymatique peut être suivie d'une homogénéisation, d'une sonication ou d'une agitation vigoureuse dans un tampon de lyse.

De plus, comme les protéases et les phosphatases endogènes peuvent être libérées lors de la rupture cellulaire et dégrader la molécule cible, l'échantillon doit être protégé pendant la rupture cellulaire et la purification ultérieure à l'aide d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases afin d'éviter une perte incontrôlée de la cible.