Réactifs et substrats d'immunodétection
Dans le Western blot, le facteur le plus important pour garantir la réussite des expériences est la qualité des réactifs utilisés. Nous proposons une gamme de réactifs pour le Western blot pré-optimisés pour agir en synergie, offrant des signaux spécifiques puissants et un faible bruit de fond afin de vous aider à obtenir rapidement des résultats dignes d'une publication.
Products
Réactifs de blocage
Le blocage des sites membranaires non liés empêche la liaison non spécifique des anticorps, susceptible d'entraîner un bruit de fond élevé. Les agents de blocage traditionnels à base de lait, de gélatine et d’autres protéines sont efficaces pour de nombreuses applications de transfert, mais peuvent réduire la sensibilité ou la détection en masquant le signal ou en interférant avec la détection de cibles protéiques spécifiques. Les réactifs Immobilon® Block Noise Cancelling comprennent des tampons sans protéines, prêts à l’emploi, optimisés pour réduire les niveaux de bruit de fond lors de la détection par chimiluminescence, fluorescence ou phosphoprotéines.
Conjugués de streptavidine et d'anticorps secondaires
Les méthodes modernes d’immunodétection reposent sur une détection enzymatique utilisant de la streptavidine ou des anticorps secondaires liés de manière covalente à des enzymes telles que la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (AP). L’enzyme conjuguée catalyse la dégradation de substrats spécifiques, ce qui entraîne la génération d’un signal. Une large gamme de conjugués de streptavidine, de protéine A, de protéine G et d’anticorps secondaires est disponible pour le Western blot. Nous proposons également un vaste choix de substrats HRP et AP pour la détection chimiluminescente, chromogénique et chimifluorescente dans le cadre du Western blot.
Substrats chimiluminescents pour le western blot
Les substrats Immobilon® HRP pour la détection chimiluminescente offrent une sensibilité accrue pour des blots plus quantitatifs, ce qui réduit les coûts en vous permettant de diminuer la concentration d’anticorps utilisée pour la détection. Choisissez parmi une gamme de substrats Immobilon® présentant différentes sensibilités, disponibles sous forme de kits prêts à l’emploi ou en deux composants, afin d’optimiser la détection pour votre application de Western blot.
- Les substrats chimiluminescents Immobilon® Classico, Crescendo et Forte constituent une gamme de réactifs prémélangés et prêts à l’emploi pour la détection à base de peroxydase, proposés dans une large gamme de sensibilités afin d’offrir des rapports signal/bruit optimaux pour un large éventail de concentrations de protéines cibles. Limites de détection :
- Immobilon® Classico : ~ 6 pg de protéine cible
- Immobilon® Crescendo : ~ 1 à 3 pg de protéine cible
- Immobilon® Forte : environ 400 fg de protéine
cible
- Les substrats Immobilon® Western HRP, Immobilon® ECL Ultra et Immobilon® UltraPlus Western offrent une sensibilité exceptionnelle et une longue durée de vie du signal dans des formats standard à deux composants. Ces formulations permettent d’utiliser des solutions d’anticorps primaires plus diluées pour la détection par immunoblot. Limites de détection :
- Substrat Immobilon® Western HRP : environ 400 fg de protéine cible
- Substrat Immobilon® ECL Ultra : ordre de grandeur des faibles femtogrammes
- Substrat Immobilon® ECL UltraPlus Western Blot HRP : plage des faibles femtogrammes
Sensibilité relative des substrats HRP chimiluminescents Immobilon®
Figure 1.Une série de dilutions doubles du lysat de cellules A431 [12-110], à partir d'une concentration initiale de 4 μg de protéines, a été soumise à une électrophorèse sur des gels mPAGE® à 10 % [MP10W15] dans un tampon MOPS [MPM0PS] à 200 V pendant 25 minutes. Les protéines ont été transférées sur une membrane Immobilon®-P [IPVH00010] pendant 1 heure dans un tampon de transfert mPAGE® [MPTRB] contenant 10 % d’éthanol. L’immunodétection de la protéine HH3 (15 kDa) a été réalisée à l’aide d’anticorps de lapin anti-HH3 [H0164] et d’anticorps de chèvre anti-lapin [AP132P] aux dilutions indiquées. Les blots ont été incubés avec les réactifs ECL indiqués pendant 5 minutes, puis les images ont été acquises avec une exposition de 30 secondes sur le système Bio-Rad® ChemiDoc.
Les réactifs de détection Cytiva™ Amersham™ ECL utilisent une méthode de détection HRP améliorée à base de luminol ; différentes formulations sont disponibles pour répondre aux divers besoins des applications de Western blot.
- Les réactifs de détection ECL Cytiva Amersham™ pour le Western blot sont recommandés pour les applications de Western blot de confirmation.
- Le réactif de détection Cytiva Amersham™ ECL Prime pour le Western blot permet de détecter à la fois les protéines à forte et à faible abondance sur un même transfert.
- Les réactifs de détection pour Western blot Cytiva Amersham™ ECL Select offrent une sensibilité élevée, même en cas d’utilisation d’anticorps primaires et secondaires dilués.
- Le réactif de détection Cytiva Amersham™ ECL Start pour le Western blot a été développé pour la détection par chimiluminescence de protéines à expression moyenne et élevée.
Substrats chromogéniques pour le western blot
La détection chromogénique utilise une enzyme conjuguée à la peroxydase (par exemple, la HRP) ou à la phosphatase alcaline (AP) pour catalyser une réaction qui entraîne le dépôt d’un précipité coloré insoluble permettant la détection. Nos substrats chromogéniques pour le Western blot sont disponibles sous forme de solution, de poudre et de comprimés afin d’offrir des options flexibles de stockage et d’utilisation.
- Les comprimés SIGMAFAST™ DAB (substrat chromogène HRP) sont composés d’un substrat précipitant colorimétrique qui produit une couleur brune lors de la réaction avec la peroxydase de raifort et peuvent être dissous dans l’eau pour préparer une solution tamponnée prête à l’emploi destinée à la détection par Western blot.
- Les réactifs uniques BCIP/NBT (bleu/violet) et BCIP/TNBT (bleu/marron) (substrats chromogéniques pour la phosphatase alcaline) sont des substrats colorimétriques hautement sensibles destinés à la phosphatase alcaline.
- Le substrat membranaire TMB Enhanced à un composant pour la HRP (substrat chromogénique pour la HRP) est un substrat colorimétrique à un composant qui produit un produit de couleur bleu foncé.
Amplificateurs de signal
- L'amplificateur de signal Immobilon® est conçu pour être utilisé dans les applications de Western blot lorsque l'intensité du signal est faible. L'amplification de la réaction anticorps-antigène peut entraîner une augmentation de 2 à 10 fois de l'intensité du signal. L'amplificateur de signal Immobilon® est compatible avec les membranes en PVDF et en nitrocellulose et peut être utilisé avec des méthodes de détection chromogéniques, chimiluminescentes et fluorescentes.
- Le kit d’amplificateur d’immunoréaction SignalBoost™ est conçu pour amplifier le signal cible chimiluminescent ou colorimétrique sur des membranes en nitrocellulose ou en PVDF.
Réactifs et kits pour le décapage et le ré-sondage
Les réactifs de décapage et de ré-incubation sont spécialement formulés pour éliminer rapidement et efficacement les anticorps des Western blots sans affecter de manière significative les protéines immobilisées.
- Les réactifs ReBlot™ Plus éliminent efficacement les anticorps liés des blots ayant subi un marquage. Les réactifs ReBlot™ Plus sont disponibles en formulations douces et puissantes.
Ressources connexes
- Guide pratique : conseils et astuces pour le transfert de protéines
Ce manuel est le fruit de l'expérience collective de nos scientifiques spécialisés dans les applications, qui contribuent activement à faire progresser la science du transfert et de la détection des protéines.
- Brochure : Repenser le western blot
Découvrez nos produits conçus pour optimiser chaque étape du protocole de Western blot.
- Article : Protocole de Western blot (protocole d'immunoblotting)
Protocole de Western blot comprenant les étapes de travail pour différentes procédures de transfert, décrivant le transfert électrophorétique de protéines à partir de gels de polyacrylamide-SDS vers des feuilles de nitrocellulose.
- Casein Blocking Buffer Protocol
Protocol for Casein Blocking Buffer in Southern and Western blotting includes troubleshooting for optimizing signal.
- Methods Used to Detect Proteins and Nucleic Acids Bound to Membranes
Background and protocols describing the various methods used by molecular biologists to detect samples of protein or nucleic acids bound to membranes.
- Gelatin Blocking Buffer for Direct Detection Southern or Western Blotting
In order to specifically detect an antigen or target molecule immobilized on a solid support, unoccupied binding sites on the support must be blocked against binding by probe and detection molecules.
- Colorimetric Detection of Western blot using 4-Chloro-1-Naphthol Solution Protocol
This solution is used as a substrate for detecting horseradish-peroxidase conjugates in Western blotting.
- Immunodetection
The possible causes and potential remedies for challenges encountered as a result of blocking, washing, antibody incubation, and detection/exposure of Western blots
- Fluorescent Multiplex Detection using Antibody Atto Dye Conjugates
Immunoblotting (Western blot transfer) is a common technique in modern proteomics research.