核酸の標識と検出

核酸の標識とプローブ

核酸は、分子全体にわたり、あるいは5’末端および3’末端に標識を付与することができます。核酸プローブは、ノーザンブロットにおけるRNAの検出やサザンブロットにおけるDNAの検出など、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用です。 プローブ全体に標識を分布させるために、標識化されたデオキシヌクレオチド（dNTP）またはヌクレオチド三リン酸（NTP）を用いたPCR、ランダムプライミング、ニックトランスレーションなど、さまざまな標識法が用いられます。末端標識は、立体障害を回避する必要がある核酸とタンパク質の相互作用を調べるアッセイにおいて特に有用です。

核酸の標識および検出アッセイ

標識法に応じて、酵素標識プローブには比色検出法が、放射性プローブにはオートラジオグラフィーによる検出法が適している。一般的なプローブには、ジゴキシゲニン（DIG）やフルオレセイン標識プローブがあり、これらを組み合わせて比色反応（例：アルカリホスファターゼ）と組み合わせることで、多色プローブ検出が可能となる。 同様に、追加の標識・検出法として、ほとんどのDNAポリメラーゼを用いてPCRによるビオチン-16-dUTPの組み込みも可能です。蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）では、蛍光プローブを用いてDNA配列を検出しますが、検出の成否およびその後の解析は、研究者が利用可能な蛍光顕微鏡の感度と分解能に部分的に左右されます。

標識DNAおよびRNAの応用

高分子を固相膜に転写するプロセスは、ブロッティングとして知られています。標識プローブの特異性により、核酸とプローブのハイブリダイゼーションを通じて、研究者は複雑な核酸混合物の中からDNAおよびRNA配列の両方を検出することが可能になります。さらに、これらの手法により、アッセイに応じて、遺伝子発現、mRNAのサイズ、コピー数の解析など、追加の貴重な情報を収集することができます。 また、イン・シトゥハイブリダイゼーションは、1つまたは複数の異なる標識を持つプローブ（例：DIGおよびフルオレセイン標識プローブ）を検出するために、研究者によって広く利用されています。