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フィルター・ろ過の豆知識!Filter Quest

フィルターやろ過の「ここが知りたい!」をクエストしてください。
普段何気なく行っている「ろ過」。わずかな工夫やちょっとした知識で、ろ過実験の作業効率はぐっと高まります!
「Filter Quest(フィルター クエスト)」では、半世紀もの歴史を持つメンブレンメーカーならではの「ろ過」に関するノウハウを掲載。ろ過、フィルターの「知って便利!」や「そこが知りたい!」にメルクミリポアがお答えします。実験の待ち時間やろ過を待つ間などに、気軽にお読みください。


目次
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Quest 1. ろ過って何?

ろ過とは、粒子径に基づいて物質を分離するために広く用いられている機械的または物理的な操作を指します。ろ過の対象は、液体、ガス、超臨界流体などさまざまで、分離の対象も多岐にわたります。そのため、一度のろ過ステップで完了する場合から、複数のろ過ステップが必要な場合まで、ろ過の方法もさまざまです。例えば、夾雑物が多い場合には、膜の目詰まりを防ぐために、複数回のろ過が必要になることがあります。

ろ過の種類生命科学分野・医療分野で用いられるろ過の種類は、「精密ろ過(Micro-Filtration: MF)」「限外ろ過(Ultra-Filtration: UF)」「逆浸透(Reverse Osmosis: RO)」の3種類(図1)で、それぞれ簡単に説明すると、精密ろ過は、約0.05~10 µmの粒子の分離(例:滅菌操作)、限外ろ過は、約1~1,000 kDa(ダルトン)の分子の分画または濃縮(例:タンパク質の濃縮)、逆浸透は、極めて低分子量の成分を分離することができ、多くの場合水の精製(例:超純水の精製)に用いられます。

これらのろ過には、メンブレンフィルターというタイプのフィルターが使われます。メンブレンフィルターは対象物を表面で捕捉するスクリーンフィルターの一種です。目的に応じて、異なる孔径のフィルターが選択されます。
これに対して、対象物を内部で捕捉するタイプのフィルターはデプスフィルターと呼ばれます。デプスフィルターは、目詰まりを防ぐための粗ろ過ステップ(Clarification)によく利用されます。

次回からは、上記3種類のろ過のうち、私たちが実際に実験操作を行うことが多い精密ろ過と限外ろ過をクエストします!



Quest 2. 急がば…

前回、メンブレンフィルターを利用して生命科学・医療分野で行うろ過の多くは、精密ろ過(Microfiltration: MF)、限外ろ過(Ultrafiltration: UF)、逆浸透(Reverse Osmosis: RO)のいずれかであると説明しました。
この中で、「ろ過」という言葉と直感的に結びつきやすいのは、滅菌ろ過に代表される「精密ろ過」でしょう。精密ろ過とは、フィルター孔径よりも大きなミクロン単位の微粒子をフィルター表面で捕捉するろ過の方法です。

プレフィルトレーションさて、その精密ろ過、「せっかくろ過を始めたのに、目詰まりしたため、やり直した」経験はありませんか?
例えば、
サンプルから沈殿を取り除こうとしたらフィルターが目詰まりして困ってしまった…
急いで滅菌済み培地を調整したかったのに、残渣が目詰まりを起こして時間をロスしてしまった…
などなど、挙げればきりがないかもしれません。

では、一体どうすれば、目詰まりを回避できるのでしょうか?
ろ過を効率よく行う大原則は「大きな粒子を先に取り除く」ことです。そのためには、精密ろ過をする前の「プレフィルトレーション*1」がおススメです。試料のプレフィルトレーションには、おおむね1 μmを超えるサイズの粒子をトラップ可能な繊維製のデプスフィルター*2がよく用いられます(図1)。
ひと手間かけることで、目詰まりのない快適なろ過が実現します。急がば回れ!なのです。

*1 事前に大きな粒子を取り除くことをプレフィルトレーション(Prefiltration)と呼びます。
*2 デプスフィルターは、対象物を表面だけでなく内部でも捕捉します。ろ過圧条件などに依存するため精密ろ過そのものには利用できません。ナイロンネットフィルター、ポリプロピレンフィルター、グラスファイバーフィルターなどがあります。


次回は、プレフィルターと精密ろ過フィルターの具体的な組み合わせや、「大きな粒子を先に取り除く」という大原則をたった一枚で実現してしまうメンブレンフィルターの仕組みをクエストします。


Quest 3. 効率重視

今回は、「精密ろ過」についてさらにクエストしましょう。精密ろ過は、おおむね0.05~10 μmのサイズの粒子を捕捉対象とし、特定のサイズよりも大きな粒子をフィルター表面で捕捉するろ過の方法です。孔径0.22 μmのメンブレンを用いる滅菌ろ過は、その代表例ということができます。
前回、説明したように、ろ過の大原則は「大きな粒子を先に取り除く」ことです。この目詰まりの原因になる大きな粒子を、予め別のフィルターでろ過して、取り除くことをプレフィルトレーションと呼びます。例えば、沈殿が生じやすい培地をろ過する場合は、AP20タイプのグラスファイバーフィルターと孔径0.22 μmのメンブレンの組み合わせがよく利用されます。

実は、この「大きな粒子を先に取り除く」というプレフィルトレーションの原則をたった一枚のメンブレンで実現してしまったスグレモノのメンブレンフィルターがあります。その名も「ミリポアエクスプレス」!
ミリポアエクスプレスミリポアエクスプレスは、一枚のメンブレン内部の構造が一次側から二次側の方向*1に小さくなるように工夫されています(図1)。この構造により、粒子の多いサンプルでもろ過が効率的に行われ、「高流量フィルター」としての威力が発揮されるのです(図2)。そのためミリポアエクスプレスは、例えば、細胞抽出液のように、様々なサイズの粒子が高濃度に混在しているサンプルの精密ろ過に大きな威力を発揮し、時間とコストの節約に繋がる非常に効率的なメンブレンフィルターなのです。

*1 ろ過サンプルが最初に触れる面を「一次側」、ろ液がメンブレンから出ていく側を「二次側」と呼びます。


2回に渡って精密ろ過をクエストしてきましたが、膜には取り除くだけでなく「濃縮・脱塩する」という得意分野もあります。次回は、タンパク質濃縮等でよく利用される限外ろ過をクエストします。


Quest 4. ろ過で濃縮

前回までは、精密ろ過の大原則を紹介してきました。今回はメンブレンフィルターで行うもう一つの代表的なろ過手法「限外ろ過」をクエストします。
限外ろ過限外ろ過は、精密ろ過の範囲よりもさらに小さな約1~1,000キロダルトン(kDa)の分子の分離に用いられます(図1)。このろ過の分離能力は、(精密ろ過のように)孔径ではなく、分子量が明らかなタンパク質やデキストランの阻止率による「公称分画分子量(NMWL)」または「分子量カットオフ(MWCO)」として表されます。
ただし、NMWL(あるいはMWCO)は、孔径のようなサイズの絶対的な基準として用いることはできません。タンパク質、デキストランなどの生体高分子は、塩濃度、pHや温度によって、同一分子であっても異なる立体構造をとることがあるからです。ほぼ同じ分子量を持つ物質同士でも、互いの分子形状の違いから、限外ろ過の阻止率が異なる場合があります。

限外ろ過また、限外ろ過を行うには高い圧力を要しますが、操作圧が非現実的なほど高くなるのを防ぐため、限外ろ過層が可能な限り薄くなるよう設計されています。
しかし、限外ろ過層単独では物理的強度が非常に弱くなるため、一般的には、支持膜あるいは基質に限外ろ過層をキャスティングした2層構造にすることで物理強度を上げています(図2)。限外ろ過用メンブレンの表面・裏面の滑らかさが異なるのはこのためです(滑らかな面が限外ろ過膜の部分です)。

メルクミリポアでは、公称分画分子量1~500 kDaに対応した遠心型、加圧型の限外ろ過膜製品を扱っています。タンパク質溶液や核酸溶液の脱塩・濃縮、ウイルス粒子の精製・濃縮など、複雑なプロセスを短時間で簡単に実現するものが多くみられます。

次回は、効率よくろ過を行うための5つのポイントをクエストします。


Quest 5. 5つのコツ

貴重なサンプルを無駄にせず効率よくろ過できれば、実験のパフォーマンスはぐんと向上します。それでは、一体どうすればいいでしょうか?そのコツはズバリ!次の5項目です。

表1・プレフィルトレーションの活用
・最適なろ過容量の選択
・フィルターの化学適合性の確認
・サンプルの吸着への配慮
・洗いによる溶出ピークの低減

プレフィルトレーションに関してはQuest 2~3で詳しく紹介しています。大きなものを先に取り除く原則を守ることで、効率的なろ過が可能になるという内容でした。

ろ過サンプルの容量に見合ったサイズのフィルターを選択することは、効率よくろ過を行う際に非常に重要なポイントです。膜面積の大きなフィルターを使うメリットは、ろ過圧を抑えつつ素早くろ過ができることです。しかし、不必要に大きな膜面積のフィルターを用いると、ホールドアップ量(フィルターに取り残されるサンプル)の増大とともに、吸着による目的物の減少が起こります。そのため、ろ過サンプルの容量にあった、最適なサイズのフィルターを選択する必要があります。表1は、サンプル量ごとのフィルターサイズの目安です。是非、参考にしてください。

表2サンプルとフィルターの化学適合性も非常に重要です。適合性の低いフィルターを使うと、溶媒がメンブレンを溶かしてしまう等のダメージにより、適切なろ過が行われなかったり、溶出によるサンプルの汚染が起こる可能性が高くなります。ろ過を実際に行う前に、表2に示すような化学適合性表を参考に、最適なフィルターユニットを選択しましょう*1

*1 ここで示す化学適合表は一般的な目安を記してあります。弊社製品に添付されたユーザーガイドには、より正確な情報が記載されています。ご使用の際は、是非、ユーザーガイドをご確認ください。

残りの2つのコツである吸着と洗い…の前に、押さえておきたいポイントがあります。次回は、材質と深く関連するメンブレンの湿潤性に関してクエストします。


Quest 6. 疎水性を親水性に!

ろ過では、サンプルはメンブレンの孔にスムーズに入り込む必要があります(これを「湿潤性」と呼びます)。図1ナイロン・セルロースといった親水性原料のメンブレンは、水溶液がメンブレンの孔に容易に入り込み完全に湿潤されるので、そのままの状態でろ過を行うことができますが、大部分のメンブレンは疎水性原料で製造されるため、そのままではサンプルがフィルター孔を通過できません。では、どのようにしているのでしょうか?

サンプルに対するメンブレンの湿潤性は、膜表面の化学的性質に大きく関係します。目安の一つは、原料ポリマーの表面エネルギーです(70 dynes/cm以上であれば親水性、それ以下であれば疎水性)。この性質は「濡れ角度」という尺度で表すこともできます。図1は、通過しようとする水溶液と微細孔のとる濡れ角度の関係を、親水性メンブレンと疎水性メンブレンで比較した模式図です。
一体どのような方法で疎水性メンブレンに湿潤性を持たせることができるのでしょうか。
例えば、アルコールは疎水性メンブレンを湿潤することができるので、疎水性メンブレンをアルコールで湿潤してから、水溶性サンプルや溶媒で平衡化して利用することも可能ですが、フィルターの製造過程ではあまり実用的ではありません。一般的には、親水性の化合物でメンブレンを処理して疎水性を克服する方法がとられています(図2)。図2具体的な方法は、親水性物質による表面のコーティング、メンブレンへの親水性物質の埋め込みや共有結合など、様々です。親水性PVDFや親水性PTFEといった表記は、これらのメンブレンが水溶性サンプルに湿潤性を持つように処理を受けたことを示しています。フィルター選択の際に注目してみてください。

一方、いかなる状況下でも湿潤しないよう、疎水性メンブレンにさらに疎水化処理を施した、疎水性あるいは超疎水性のフィルターも存在します。超疎水化処理をしたメンブレンは、水やアルコールで湿潤させることはできません(超疎水性メンブレン)。疎水性メンブレンは、エアベントアプリケーションにおいて液体からの気泡の放出、または液体と外気の間のガス交換を可能にする多孔質隔壁として用いられます。

次回は、ろ過の5つのコツに戻り、残り2つのコツ「メンブレンへの吸着の影響」と「メンブレンの洗浄の効果」をクエストします。




Quest 7. 5つのコツ Part. 2

Quest 5で、途中まで説明した「ろ過を行う際の5つのコツ」、今回は、残りの2つの「サンプルの吸着への配慮」と「洗いによる溶出ピークの低減」について、説明していきましょう。図1

フィルターを通過する際に、サンプルの一部が失われたり汚染されたりする可能性を、皆さんはどれくらい意識していますか?
サンプルとメンブレンの化学的性質に依存*1によって、サンプル中の物質が非特異的にフィルターに吸着すると、再現性に乏しく不正確な結果が生じます。特に、ろ過サンプルが低濃度の場合には、非特異的吸着に注意する必要があります。
例えば、グラスファイバーフィルターは、タンパク質、ペプチドやオリゴヌクレオチドを吸着しやすい特性がありますし、ナイロンフィルターは非常に高いタンパク質吸着性を持っています。サンプルの吸着を抑えるには、親水性PVDF製のデュラポアや、PES(ポリエーテルスルホン)製のミリポアエクスプレスといった低吸着フィルターメンブレンが適しています。

吸着とは逆に、ろ過したサンプルが溶出*2によって汚染されてしまう可能性もあります。
溶出を減らすコツは、サンプルと化学適合性の高いフィルターユニットを選択することだけではありません。多くの場合、溶媒、あるいは(余裕がある場合には)サンプルで一度フィルターを洗うことで、溶出を低く抑えることが可能です。図2は、シリンジフィルター洗浄により、LC-UVで検出されない程度まで溶出物ピークを減少させた例ですが、たった1 mLの溶媒による洗いの後に2 mLのサンプルをろ過し、溶出をHPLCにより比較した結果です。フィルターを洗うことで溶出ピークが大きく減少しているのが分かります。図2
是非、Quest 5と今回紹介した5つのコツを意識して、効果的なろ過を行ってください。

*1 非特異的吸着の起こりやすさは、メンブレンの材質とサンプルに含まれる物質の化学的性質に依存します。相性の良い組み合わせ(例えば、タンパク質と親水性PVDFメンブレン)では非特異的吸着はほとんど起こりませんが、相性が悪い組み合わせ(例えば、核酸とグラスファイバーフィルター)は非特異的吸着に注意する必要があります。
*2 溶出(抽出)とは、メンブレンやハウジングから、特定の物質が溶媒やサンプル中へ溶けだすことです。サンプルとフィルターの化学適合性が十分高い場合でも、フィルターユニットとそこを通るサンプルの化学的性質の組み合わせによって、溶出が起こることがあります。


次回は、タンパク質サンプルのろ過や細胞培養用培地の滅菌に焦点を当てた「培地調製のコツ」を説明します。


Quest 8. 培地調製のコツ

今回は、特に添加剤・培地調製時のろ過滅菌のコツを紹介します。

タンパク質に代表される生体高分子の多くは、熱により変性・失活してしまうため、オートクレーブによる滅菌は適していません。また、化学的な滅菌方法は、サンプルや培地の組成に影響するため適切ではありません。そこで通常は、タンパク質添加剤や細胞培養用の培地では、ろ過による滅菌が選択されます。
このろ過による滅菌で気をつけたいポイントがひとつあります。勘のいい方はもうお分かりかもしれません。それは、フィルターへの非特異的吸着です!

Quest 7では、グラスファイバー、ナイロン、PES(ポリエーテルスルホン)、親水性PVDFなどのさまざまな材質のメンブレンが持つ吸着の特性を紹介しました。これらのタイプの精密ろ過メンブレンの内部表面積は前面表面積の100~600倍にのぼるため、各々の化学適合性に依存して非特異的な吸着の原因になることがあります。
表1Filter Questに登場するメンブレンの中では、タンパク吸着性が極めて低いために最も高い回収率を実現可能な親水性PVDFメンブレンが、最適なメンブレンとしてしばしば選択されます(表1)。また、メルクミリポアのPES製メンブレン「ミリポアエクスプレス」(Quest 3参照)も、高い回収率と低いタンパク質吸着性を併せ持つ有用なフィルターです。
タンパク質サンプルや培地をろ過するときは、親水性PVDFメンブレンあるいはPESメンブレンを選択することで、サンプルや培地の組成に影響が少ないろ過滅菌が可能になります。

ところで、ろ過滅菌用のフィルターユニットがどのように滅菌されているかご存知ですか?フィルターユニットの滅菌には、メンブレンやハウジングの材質ごとに、適した滅菌方法が存在します。次回は、フィルター製造時の滅菌方法に関してクエストします。


Quest 9. たかが滅菌、されど…

培地調製等に用いる滅菌済みフィルターを選ぶ際、製造時の滅菌方法を確認したことはありますか?
滅菌済みフィルターは、製造時にメンブレンやハウジングの種類に応じた適切な滅菌方法が選択されます。その秘密とは…

滅菌フィルター多くの研究室で日常的に使用されているオートクレーブは簡単かつ便利な滅菌法です。しかし、滅菌済みMillex(マイレクス)を始めとするフィルターユニットの製造では、オートクレーブ滅菌は現実的ではありません。インディケーター(滅菌済みを示す色が変わるテープ)をハウジング内部に挿入できず、蒸気由来の残存物質による汚染リスクも高いからです。
また、エチレンオキシド(EO)は、デバイスに浸透して生物由来物質を完全に失活させる気体です。一見、便利なようですが、滅菌処理から包装完了までずっと無菌性を確保する必要があり、容易な方法ではありません。
以上の理由から、今日では多くのメーカーがフィルターユニットの滅菌にγ線照射を用いています。γ線がデバイスを通過する時に、タンパク質、RNA、DNAなどの物質を破壊し、微生物を不活化します。この方法のデメリットは、互換性のない原料ポリマーの存在です。特に、PTFEメンブレンはγ線照射が推奨されず、EO処理が採用されます。
メルクミリポアでは、大部分のメンブレンの滅菌にはγ線照射を、PTFEなどの一部のメンブレンの滅菌にはEO処理を採用しています。それらの滅菌法に適合した材質のハウジングと組み合わせ*1、品質と滅菌性が適切に保たれたフィルターユニットが製造されています。

*1 ハウジングの化学的性質から滅菌方法が選択される場合もあります。

さて、次回はいよいよ最終回、製造時にフィルターの品質がどのようにチェックされているかをクエストします。


Quest 10. 品質本位

フィルターユニットには様々な品質試験法が存在します。最終回は、孔径に対する品質検査の代表、完全性試験を紹介します。品質に対するメルクミリポアの取り組みを通じて、メンブレンフィルターをさらによくご理解ください。

完全性試験の概要完全性試験には、破壊試験と非破壊試験の2種類があります。

破壊試験:メルクミリポアで行っている破壊試験は、バクテリアチャレンジ試験(ASTM F838-83準拠)です。0.22μmシリンジフィルターでろ過した107cfu/cm2あるいはそれ以上の濃度のバクテリア(Brevundimonas diminuta ATCC 19146)のろ過液を、0.45μmフィルターでろ過します。0.45μmフィルターを寒天培地上で培養し、0.22μmフィルターを通過した細胞数を確認することで、シリンジフィルターの完全性が評価されます。
非破壊試験:使用前だけでなく使用後の確認も可能な試験法です。親水性フィルターに対する非破壊的試験には、主に、「バブルポイント試験」「拡散流量試験」の2種類があります。 メルクミリポアでは小型フィルターユニットのバブルポイント試験を簡単に実施するための「簡易型完全性試験キット」も取り扱っています。

ろ過の種類から品質検査法まで、ろ過にまつわる豆知識やコツを紹介してきたFilter Quest、いかがでしたか?Filter Questを活用して、是非、より楽しく効果的なろ過実験を行ってください!

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