Anti-N1-Phosphohistidine (1-pHis) Antibody, clone SC50-3

リン酸化は、細胞のタンパク質活性およびさまざまな細胞シグナリングイベントの制御において重要な役割を担っています。ホスホヒスチジン（pHis）の検出に利用できるツールには限りがあるため、ほとんどの研究はセリン、トレオニンおよびチロシンのリン酸化が中心となっています。ヒスチジンのリン酸化は、イミダゾール環のN1（1-pHis）およびN3（3-pHis）で生じます。1-pHisおよび3-pHisの安定ホスホリルトリアゾリルアラニンアナログ（1-pTzaおよび3-pTza）を有するペプチドの開発によって、シグナリングイベントにおけるヒスチジンN1およびN3のリン酸化を研究するための抗体の産生が可能となっています。がんおよび腫瘍転移におけるHisキナーゼに関連するエビデンスは増加しており、最初に同定された転移抑制遺伝子は、2つの既知の哺乳類Hisキナーゼのうちの1つNm23-H1（別名：NME1、ヌクレオシド二リン酸キナーゼまたはNDPK-A）です。Nm23-H1/NME1および極めて類縁のNm23-H2（NME2/NDPK-B）は、1-pHis酵素中間体を介して、ATPからヌクレオシド二リン酸（NDP）へのリン酸の転移を触媒します。Nm23-H1/-H2は、Hisキナーゼ活性も有し、活性部位のpHisから標的タンパク質のHisにリン酸を転移します。ホスホグリセリン酸ムターゼ（PGAM）、スクシニルCoA合成酵素（SCS）およびATPクエン酸リアーゼ（ACL）といった代謝酵素も、酵素中間体としてpHisを使用します。NME1/2とは異なり、PGAMは、酵素中間体として3-pHisを使用します。真核生物だけでなく、化学走性に関与する細菌の“2成分”のシグナル伝達経路でもヒスチジンのリン酸化がよく知られていますが、リン酸は受容体／センサータンパク質で形成されたpHisから受容体反応制御タンパク質のAsp残基に転移し、受容体／センサータンパク質は実質的にアスパラギン酸キナーゼとして機能します。

ヒスチジン‐リン酸化タンパク質の組み合わせにより変わることがあります。

エピトープ：N1-ホスホヒスチジン（1-pHis）

非加水分解性ホスホヒスチジンアナログの1-pTzaを有するKLH結合体のランダムペプチドライブラリ－。

Anti-N1-Phosphohistidine （1-pHis） Antibody、クローンSC50-3は異性体特異性を示すモノクロナールAbであり、N1位置でリン酸化されたヒスチジンを特異的に検出します。この精製mAbについてはデータが公表されており、ウェスタンブロッティングとドットブロッティングにおける性能を知ることができます。

ドットブロット解析：代表的なロットを使用して1-pTzaを含むペプチドを検出しましたが、3-pTzaホスホヒスチジン類似体は検出しませんでした。クローンSC50-3は、リン酸化チロシンのみを含むペプチド、非リン酸化ヒスチジンに対してはまったく免疫活性を示しませんでした（Fuhs, S.R., et al. （2015）.Cell. 162（1）:198-210）.

ウェスタンブロッティング：クローンSC50-3のハイブリドーマ培養上澄み液を使用して、形質転換E. coliとHEK293形質転換体から調製したライセート中の外因的に発現したNM23-H1/NME1融合タンパク質の熱敏感性ヒスチジン N1-リン酸化（1-pHis）検出を目的とするウェスタンブロッティング分析を行ないました（Fuhs, S.R., et al. （2015）.Cell. 162（1）:198-210）.

注記：ホスホヒスチジン検出の前にサンプルを加熱しないでください。ヒスチジンのリン酸化は熱と酸に対して不安定です。サンプルアりコートを95ºCで10-15分程度加熱するとヒスチジンのリン酸化が逆方向へ進みますから、これによって特異性テストの感度を下げる方向へ調節することができます。別法として、サンプルアリコートを酸性pH、37ºCで15分程度インキュベートするとヒスチジンのリン酸化レベルが下がります。インキュベーション開始前にサンプル100 µLあたり25 µLの1 M HClを添加して酸性化しておき、ホスホヒスチジン検出の前に25 µLの1 M NaOHを添加して中性に戻します。

イミダゾール環のN1位置でリン酸化されたヒスチジン（1-pHis）を含むタンパク質を選択的に検出しますが、3-pHisは検出しません。

標的とする修飾は種特異的ではありません。

フォーマット：精製

NME1自己リン酸化反応のウェスタンブロッティングにより評価されています。

ウェスタンブロッティング：この抗体の0.24 µg/mLを使用して、5 µgの自己リン酸化反応ライセート中の、N1-ホスホヒスチジ（1-pHis）を含むリコンビナント・ヒトNME1（NM23-H1）を検出しました。

濃度：ロットに固有のデータシートを参照してください。