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Merck

標準PCRプロトコル

PCRの方法

標準的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のセットアップは以下の4つのステップで構成されています:

  1. 必要な試薬またはマスターミックスとテンプレートをPCRチューブに加える。
    *加熱蓋のないサーマルサイクラーでは、蒸発を防ぐためにミネラルオイルを加えます。
  2. サーマルサイクラーとプライマーのパラメーターに従って増幅します。
  3. アガロースゲル電気泳動と臭化エチジウム染色によって増幅DNAを評価します。
PCRチューブはPCRの増幅ステップのためにサーマルサイクラーにセットされる。

これらの手順を、材料と試薬選択のヒントとともに、より詳細に以下に示す。これはTaq DNAポリメラーゼを用いた基本的なPCRプロトコールである。

PCR Steps and Essential PCR Components

PCR反応のトラブルシューティングには多くの要素が含まれます。このアニメーションを見ながら、ニーズに合ったコンポーネントとサイクリング条件を選択することで、どのように最適な結果を得ることができるかを学びましょう。

プロトコルのPCR技術ガイドのセクションで、他のポリメラーゼや高度なPCR技術に関する追加のプロトコルを見つけてください。

標準的なPCRについては、PCR Basics page.

試薬：PCRには何が必要ですか？

Taq ポリメラーゼとは何ですか？

Taq DNA ポリメラーゼは、好熱性細菌であるThermus aquaticusに由来する耐熱性酵素です。  は一般にPCRでDNA断片を増幅するのに用いられる。この酵素は組換え型で、大腸菌で発現する。この酵素は、（PCR法で要求される）95℃への繰り返しの加熱にも、活性を著しく失うことなく耐えることができる。酵素の分子量はSDS-PAGEで約94kDaで、エンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼ活性は検出されない。5'→3'DNAポリメラーゼ活性と5'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有する。各ロットのTaq DNA Polymeraseは、PCR増幅および二本鎖シーケンシング用に試験されています。酵素は5 ユニット/µLで供給され、最適化された10x反応バッファーが付属しています。

Standard Taq <DNA ポリメラーゼ

下の表を参考に、反応条件に適したTaq DNAポリメラーゼを選択してください。塩化マグネシウム(MgCl2)の有無にかかわらず、透明または赤色に染色された製剤、またはバッファーとdNTPsを含む調製済みのレディミックスまたはマスターミックスからお選びください。

単位定義：1単位は、74℃で30分間で、10nmolの全デオキシリボヌクレオシド三リン酸を酸沈殿性DNAに組み込みます。

手順：PCR のステップ

Taq DNAポリメラーゼ、鋳型DNA、プライマー、MgCl2の濃度の最適条件は、利用するシステムによって異なる。各成分の最適条件を決定する必要があるかもしれない。これは特にTaqDNAポリメラーゼ、サイクリングパラメーター、MgCl2濃度に当てはまる。

  1. 試薬を適切な大きさのチューブに、表の順序で加える。(反応のセットアップに適切な表を選択する。標準試薬またはレディミックス試薬。) 多数の反応を行う場合は、テンプレートを含まないマスターミックスをセットアップし、反応チューブに分注する。最後にテンプレートを適切なチューブに加える。

*バッファーとTaqポリメラーゼを一緒に購入してください： D1806, D4309 または D4545

レディミックスPCR反応

2. ボルテックスで穏やかに混合し、短時間遠心して全成分をチューブの底に集める。

注意：加熱蓋のないサーマルサイクラーを使用する場合は、蒸発を防ぐために各チューブの上部に50μLのミネラルオイルを加える。

3. 増幅 増幅パラメーターは、使用するプライマーやサーマルサイクラーによって異なります。

典型的なサイクルパラメーター

25～30サイクルの増幅を推奨します。

4.増幅されたDNAは、agarose gel electrophoresis and subsequent ethidium bromide staining.

      Note: Mineral oil overlay may be removed by a single chloroform extraction (1:1), recovering the aqueous phase.

  • アガロース
  • （プレキャストゲル、パウダーなど。
  • MOPS-EDTA-酢酸ナトリウム、トリス-酢酸-EDTA（TAE）、トリス-ホウ酸-EDTA（TBE）などのバッファー
  • ゲルローディング液、サンプルローディングバッファー。ゲルローディング溶液およびRNA用サンプルローディングバッファー
  • 電気泳動染色剤または色素（臭化エチジウムなど）
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レーベル ライセンス ステートメント

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