細胞培養のコンタミネーションに関するトラブルシューティング
培養の汚染：
細胞培養のコンタミネーションというと、一般的には細胞内のバクテリアや濁った培地を思い浮かべますが、培養フラスコ内の不要な侵入者はさまざまな形で現れる可能性があります。
細胞汚染はどの程度広がっているのでしょうか？FDAやATCCなどの研究によると、今日、全ての細胞培養の5-30％がマイコプラズマ種だけで汚染されていると推定されている。ある研究では、一般的な細胞株へのウイルス汚染の発生率は25％を超えており5、非サイトパシーウイルスは、培養の健康状態からその存在を知る手がかりが得られない可能性があるため、マイコプラズマよりも検出を逃れる可能性が高い。
図1.細胞の汚染
特定の汚染物質をコントロールする鍵は、時にその検出のしやすさに関係する。細菌、真菌、酵母の汚染物質は、肉眼で確認できることが多く、培養中の細胞をすぐに死滅させることがあるが、マイコプラズマのような重要な微生物の侵入は、微妙な形態により同定が難しくなることがある。
近年、生物学のコミュニティが直面している最も重大な懸念のひとつは、研究用細胞株の汚染、あるいはまったくの誤認です。この重要な話題については、click here to understand the causes and prevalence of cross-contaminated cell lines, and how to evaluate the integrity of cell line identity.
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細菌、真菌（カビを含む）、酵母の汚染は通常、培養液の急速な濁りや色の変化として肉眼で確認できます（ただし、培地には、最も一般的な無毒性pH指示薬であるフェノールレッドを添加する）。標準的な光学顕微鏡検査でも細菌細胞や真菌構造が明らかになるため、培養液を毎日顕微鏡で観察することで、微生物汚染の早期発見を確実にし、最初の兆候が明らかになったらすぐに適切な処置をとることができる。特に、汚染された培養物を速やかに除去することは、隣接する培養物や、培養インキュベーター、培養槽、バイオセーフティキャビネットなどの無菌組織培養環境を守るために必要である。さらに、testing for bacteria and fungi should be used as a part of a routine and regular 品質管理スクリーニング手順.
微生物汚染の一般的な原因と予防
マイコプラズマは細胞壁を持たない細菌属であるため、細胞壁の形成を阻害することで細菌の増殖を制限する抗生物質の影響を受けない。その柔軟な形態と0.15～0.3µmの細胞サイズは、0.22µmの孔を持つフィルターを使用することが多い標準的な細胞培養ろ過アプローチから逃れることができる。他の多くの細菌汚染物質とは異なり、マイコプラズマは、その形態と著しく小さいサイズのために、何気なく見ただけではわからないし、光学顕微鏡で検出することも困難である。培養中のマイコプラズマの力価は、培地の濁りを引き起こすことなく、108 organisms/mLに達することができる。通常、感染した哺乳類細胞を死滅させることはないが、細胞代謝を変化させ、染色体異常を引き起こし、細胞増殖を遅らせ、細胞接着を妨害することにより、培養に大きな影響を与える。要するに、感染した細胞株を用いて行われるほとんどの実験の結果に劇的な影響を与える可能性が高いのである。
図2.DAPIやHoechstのような一般的なDNA検出剤は、蛍光顕微鏡を使って、汚染された培養物中のマイコプラズマの存在を明らかにする（右）。
実験室におけるマイコプラズマの汚染源は様々であり、難しい問題である。ウシ胎児血清のような汚染されたサプリメントを介した導入に加えて、ある種のマイコプラズマはヒトの皮膚に見られるため、不十分な無菌技術によって導入される可能性がある。0.22μmや0.45μmの孔を持つ標準的な培地濾過装置では、これらの小さな生物を排除することができないため、0.1μm以下の孔を持つ膜で培地や緩衝液を濾過することがマイコプラズマ処理には必要である。
マイコプラズマ汚染の予防、検出、除去
一旦マイコプラズマが培養物を汚染すると、すぐにラボの他のエリアに広がってしまいます。適正な実験室業務 が鍵であり、マイコプラズマ汚染をうまくコントロールするためには、マイコプラズマのルーチン検査が強く推奨される。最もポピュラーな3つの検出方法には、マイコプラズマ培養, DNA staining method and PCRに基づく検出。マイコプラズマの検出と除去のための様々なソリューションを提供します。たとえ研究室でこの汚染物質の存在を疑っていなくても、培養物のマイコプラズマ・スクリーニングのルーチンを確立することは非常に重要です。
Preventing microbial contamination: are antibiotics the answer? 組織培養の1つに、単独または抗真菌剤とのカクテルで抗生物質を日常的に使用することがあります。医師が処方する治療用抗生物質と同様に、抗生物質の継続的あるいは不適切な使用は、根絶が困難な耐性株の発生につながり、細胞培養に有毒な可能性のある後世代の抗生物質の使用を必要とする可能性がある。最近の研究では、抗生物質の存在下で培養細胞の遺伝子発現が変化する可能性について、さらなる懸念が提起されている。 |
ウイルス汚染
ウイルスは、ほとんどの研究室では実用的でない顕微鏡検査法を必要とする、最も困難な細胞培養汚染物質のひとつです。ウイルスは、培養中の検出が最も困難な細胞培養汚染物質の一つであり、ほとんどの研究室では実用的でない顕微鏡検査法を必要とする。また、バイオテクノロジー的に重要ないくつかの細胞株は、内在性レトロウイルスを含んでいることが示されている。ウイルスはサイズが小さいため、培地、血清、その他の生物学的由来の溶液から除去するのは非常に困難である。しかし、ほとんどのウイルスは宿主や組織にさえ制限されているため、種を超えた感染や組織を超えた感染が制限される可能性がある。
培養細胞に影響を与える可能性だけでなく、ウイルスに感染した細胞培養物を使用する際の大きな懸念は、実験室職員に健康被害を与える可能性である。 潜在的に危険な組織、培養物、またはウイルスを扱う手順については、研究所の環境安全担当者に相談すべきである。細胞培養を扱う研究室職員のリスクアセスメントについては、click here
細胞培養のウイルス汚染の発生を減らすためのベストプラクティス：
*細胞を抽出する生物学的供給源（供給者、動物）の数を制限する。
*ウイルスに感染しにくい動物や細胞を選ぶ。
*ウイルス検査を実施し、ウイルスフリーの細胞株であることを証明するレポジトリから細胞を調達する。
。化学汚染
細胞培養のあらゆる非生物汚染物質は、しばしば"化学"汚染物質として分類されます。これらの汚染物質は、培地や緩衝液に使用される試薬や水、あるいは装置や消耗品に由来することがあります。例としては、フリーラジカル、金属イオン、消毒剤／洗剤の残留物、あるいは上流の細菌汚染物質が存在しなくなった後も持続する内毒素などがあります。
化学汚染を防ぐためのヒント：
実験室レベルの水を、緩衝液や溶液の調製、凍結乾燥試薬の再懸濁に常に使用してください。
*再利用可能な実験器具は、十分にすすぎ、空気乾燥させる必要があります。
*培地、サプリメント、血清（FBS、FCS）は、エンドトキシン検査証明を提供するサプライヤーからのみ入手すること。
General Tips and Techniques for Preventing and Eliminating Contamination<
生物学的安全キャビネット内での作業
バイオセーフティキャビネット内で作業する際には、空気の流れが無菌環境を維持するための鍵であることを覚えておくと便利です。効果的なエアフローを実現するために、背面と前面の通気口は常に開けておく必要があります。
使用する物品をキャビネットに入れる前に、送風開始後少なくとも20分は経過している必要があります。キャビネットに入るすべての物品は、最初に70%(v/v)の滅菌アルコールをスプレーし、リントフリーワイパー で拭き、ほこりや微粒子がキャビネットに入るのを防がなければなりません。上蓋や容器を開ける前に、気流が十分に確立されていることを確認し、作業エリアに入り込んだ可能性のある微粒子をパージできるようにします。
図3.安全キャビネット内での作業
ピペットとエアロゾルの防止
使い捨てのプラスチックピペット。使い捨てプラスチックピペットは、血清ピペットとも呼ばれ、1～100 mLの容量があり、細胞培養には欠かせない道具です。無菌性を確保するため、個別に包装する必要がある。
- 自動ピペット補助器具を使用し、各ピペット補助器具は1つのキャビネットでの使用に限定する。汚染を避けるため、ピペット補助器具の部品を定期的に分解し、消毒する。
- 可能な限り栓付きピペット（上部を綿で塞いだもの）を使用し、特に培地を移す際には、ピペットの栓に液体を引き込まないようにしてください。
- 血清ピペットのラップを部分的にほどき、端をピペット用補助器具に取り付け、紙スリーブを取り外します。
- 汚染エアロゾルの発生を避けるため、培地やピペットに気泡を作らないようにします。
消毒。
培養廃棄物、作業面、機器の消毒/汚染除去のために設計された方法は、汚染リスクを最小限に抑えるだけでなく、ラボの職員にとって安全でなければなりません。濃縮タイプの消毒剤を使用する際は、手袋や目の保護具など、常に適切な個人用保護具（PPE）を着用する。選択した手袋は、取り扱う物質を保護するものでなければならない。メーカーのチャートから、作業に最適な手袋を特定することができます。主な消毒剤はグループに分けられ、その相対的な利点は以下のようにまとめられる：
次亜塩素酸ナトリウムまたは漂白剤
- 優れた汎用消毒剤
- ウイルスに有効
- 金属に対して腐食性がある-遠心分離機のような金属表面には使用すべきではない。
- 有機物によって容易に不活性化されるため、頻繁に新しくする必要がある
- 廃液や表面の消毒には、市販の漂白剤を使用して 10% (v/v) の溶液を作成する
アルコール (例: エタノール、イソプロピル)。エタノール、イソプロパノールなど）
- 効果的な濃度：エタノールは 70%、イソプロパノールは 60～70%
- 細菌に効果的です。エタノールはほとんどのウイルスに効果的ですが、非エンベロープウイルスには効果がありません
- イソプロパノールはウイルスには効果がありません
- アルデヒドは刺激性であり、その使用は制限されるべきです
フェノール系消毒剤は、EU の殺生物性製品指令の審査プログラムの一部としてサポートされていないため、避けるべきです。
健康な細胞の定期的なモニタリングの方法
細胞培養のモニタリングは、日々の細胞培養の重要な部分です。このチュートリアルでは、健康な培養がどのように見えるか、細胞のコンフルエント、細胞培養の成長のさまざまな段階など、細胞をモニタリングするための基本を説明します。このビデオでは、細菌やマイコプラズマ汚染の一般的な指標も紹介します。
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