고분자 HPLC

역상 생체 분자 HPLC

역상 HPLC(RP-HPLC)는 단백질, 단백질 조각 및 펩타이드를 분리하고 분석하는 데 사용되는 민감하고 다용도적인 기술입니다. RP-HPLC는 비극성 고정상과 극성 이동상을 사용합니다. 고정상에서 단백질과 펩타이드는 흡착 및 분할 원리를 따릅니다. 소수성 단백질 영역은 고정상에 가역적으로 부착됩니다. 단백질은 이동상의 비극성 특성을 증가시킴으로써 용출됩니다. 분해능은 기공 크기, 입자 크기, 컬럼 길이 및 고정상에 부착된 탄화수소 사슬에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)

크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 크기(즉, 유체역학적 반경)로 분자를 분리하는 비변성 크로마토그래피 모드입니다. 이 모드는 고정상과의 분석물 상호 작용에 의존하지 않고 고정상 입자를 통한 무작위 분석물 흐름에 의존합니다. 고분자량 분석물질은 고정상 입자 기공에서 완전히 또는 부분적으로 배제되기 때문에 더 일찍 용출되는 반면, 저분자량 분석물질은 입자를 통과하는 험난한 경로를 탐색하는 데 더 많은 시간을 소비하기 때문에 더 늦게 용출됩니다. SEC는 단일 클론 항체(mAb) 응집체 및 단편 특성화, 미지의 단백질 분자량 추정, 단백질 제형 안정성 측정에 사용되어 왔습니다.

소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)

소수성 상호 작용 크로마토그래피(HIC)는 소수성 분석물 모티지와 소수성 고정상 리간드 간의 상호 작용 정도에 따라 분석물을 분리하는 크로마토그래피 모드입니다. 분자량이 낮고 접히는 경향이 낮기 때문에 HIC는 일반적으로 펩타이드 분리에는 사용되지 않습니다. 염 농도가 높으면 단백질 수화 층이 소수성 표면 영역이 비극성 고정상과 인터페이스할 수 있을 만큼 충분히 파괴될 수 있습니다. 염 선택은 단백질 수화 층을 방해하거나(카오트로픽) 단백질 수화 층 형성을 촉진하는(코스모트로픽) 능력에 따라 양이온과 음이온을 분류하는 호프마이스터 계열에 따라 결정됩니다. 대표적인 염에는 황산암모늄, 황산칼륨, 황산나트륨 등이 있습니다. 소수성 상호 작용 크로마토그래피는 현재 항체-약물 접합체(ADC)의 약물 대 항체 비율(DAR) 프로파일을 결정하는 데 사용되고 있습니다.

이온 교환 크로마토그래피(IEX)

이온 교환 크로마토그래피(IEX)는 분석 물질을 전하별로 분리하는 크로마토그래피 모드입니다. 단백질과 펩타이드는 양쪽성이므로 산성 및 염기성 기능을 모두 나타냅니다. 산성 단백질 기능에는 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 티로신 및 C-말단 α-카복실산염이 포함됩니다. 기본 단백질 기능에는 아르기닌, 히스티딘, 라이신 및 N-말단 α-아민이 포함됩니다. 생체 치료용 전하 변이는 IEX로 감지하고 해결할 수 있습니다. 전하 변형은 메신저 RNA(mRNA) 전사체 오번역 및/또는 탈아미드화, 산화 또는 글리코실화와 같은 번역 후 변형에서 발생할 수 있습니다.

분석물 등전점(pI)에 따라 IEX 컬럼을 선택해야 합니다. 이동상 pH가 pI보다 낮으면 분석물은 양전하를 띠고 양이온 교환 칼럼에 결합하게 됩니다.이동상 pH가 pI보다 높으면 분석물질은 음전하를 띠고 음이온 교환 컬럼에 결합합니다.

친화 크로마토그래피

친화 크로마토그래피는 분석물질과 고정상 리간드 간의 특정 상호 작용에 의존합니다. 이상적으로는 관심 있는 분석 물질만 고정상과 상호작용하여 다른 모든 시료 성분이 컬럼을 통과할 수 있도록 합니다. 그런 다음 두 번째 이동상이 컬럼을 통과하여 분석물을 용리합니다.

단백질 A 크로마토그래피는 바이오 제약 산업에서 가장 일반적으로 사용되는 친 화성 크로마토그래피의 형태입니다. 단백질 A는 황색 포도상구균의 세포벽에서 발견되는 42kDa 표면 단백질입니다.이 단백질은 IgG의 Fc 영역에 있는 중쇄에 특이적으로 결합하기 때문에 다른 시료 성분으로부터 IgG를 분리하는 데 이상적인 메커니즘입니다. 대부분의 단백질 A 컬럼은 다공성 유기 입자에 단백질을 고정하여 제조됩니다. 그러나 단백질 A 크로마토그래피용 모놀리식 형식이 생산되어 효율 저하 없이 다양한 유속에서 높은 샘플 처리량을 제공할 수 있습니다.