밀리셀^® 행잉 인서트를 이용한 대장 오가노이드 단일층 배양

섹션 개요

• 오가노이드 유래 단일층의 개요 및 장점
• 오가노이드 유래 단일층 생성
• 밀리셀^® 인서트 코팅을 위한 GFR Matrigel^® 최적 비율 결정
• 밀리셀^® 인서트 상의 오가노이드 유래 단일층에 대한 생사 세포 생존율 염색
• 밀리셀^® 인서트 상에서의 단일층 형성 모니터링
• 밀리셀^® 인서트 상 단일층의 분화 유도
• Millicell^® 인서트 상 단일층의 ICC 염색 및 이미징
• PDO 및 hi-PSC 오가노이드 유래 단일층 워크플로우 최적화
• 밀리셀^® 인서트 코팅 및 시딩을 위한 팁과 요령

오가노이드 유래 단일층 배양의 개요 및 장점

투과성 인서트에서 배양된 오가노이드 유래 단층 배양(2.5차원 세포 배양으로도 알려짐)은 3차원 오가노이드 모델과 보다 전통적인 2차원 체외 방법 사이의 간극을 메웁니다. 환자 조직 유래(PDO) 또는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 유래된 오가노이드는 생리학적으로 관련성이 높은 모델을 제공하여 원발성 상피 조직을 밀접하게 모방합니다. 투과성 인서트 위에서 오가노이드를 단층으로 배양함으로써 연구자들은 전상피 전기 저항(TEER) 측정에 유리한 균일하고 잘 정의된 상피층을 구축할 수 있습니다.

기존 단층 배양에 비해 오가노이드 유래 단층 배양은 여러 장점을 제공합니다. 강화된 장벽 특성을 보이며, 더 단단한 접합부와 향상된 TEER을 통해 장벽 무결성을 더 정확하게 평가할 수 있습니다. 또한 오가노이드는 세포 다양성을 유지하여 생체 상피 조직의 복잡성을 더 잘 재현합니다. 투과성 막 인서트에서 배양된 오가노이드 유래 단층 배지는 정밀한 실험 조작 및 측정을 가능하게 하여 약물 흡수 메커니즘, 질병 병리학, 장내 미생물군과의 상호작용 연구를 용이하게 합니다. 본 연구에서는 Millicell^® 24-well 매달린 세포 배양 인서트에서 배양된 오가노이드 유래 단층 배지의 생성, 최적화 및 평가에 대한 포괄적인 지침을 제시합니다.

오가노이드 유래 단일층 생성

iPSC 유래 대장 오가노이드(SCC300)의 단일 세포 분해

본 단일 세포 분해 실험에는 Millicell^® 24-well 매달린 인서트(PTRP24H48)를 사용하였으며, 인서트당 세포 밀도는 2x10⁵ 세포였습니다. 인서트는 1X PBS에 용해된 2% GFR Matrigel^®로 코팅하여 37°C에서 최소 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 처리하였습니다.

참고: 분해 프로토콜 시작 전에 인서트를 코팅하십시오. 본 프로토콜은 hiPSC 유래 대장 오가노이드(SCC300) P21 6일차, 2 x 10 cm 접시에서 채취한 120 x 25 µL 돔을 기준으로 합니다. Accumax (SCR006) 및 1X PBS와 같은 모든 시약에 10 µM의 1X ROCKi (SCM075)를 첨가하십시오.

1. 10mL 피펫을 사용하여 10mL의 차가운 1X PBS+1X ROCKi에서 120 x 25 µL 돔을 분리하고 분해하십시오.
2. 오가노이드 현탁액 2.5 mL를 4개의 50 mL 원추형 튜브(50 mL 원추형 튜브당 30-40 x 25 µL 돔)에 각각 옮기고, 현탁액을 측면에 5-10회 부딪혀 Matrigel^® 돔에서 오가노이드를 더 분리합니다.
3. 각 튜브를 얼음처럼 차가운 1X PBS+1X ROCKi로 30mL까지 채우고 2000 rpm (872 x g)에서 10분간 원심 분리합니다.
4. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 4개의 50mL 원추형 튜브에 있는 각 침전물을 5mL의 얼음처럼 차가운 1X PBS+1X ROCKi로 재현탁시킵니다.
5. 2개의 50 mL 원뿔형 튜브에 있는 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 모읍니다. 나머지 2개의 50 mL 튜브에 있는 현탁액도 동일한 방법으로 처리합니다. 참고: 이 단계에서 현탁액을 15 mL 원뿔형 튜브로 옮기면 침전물 일부를 잃지 않으면서 잔여 Matrigel^®을 제거하는 데 도움이 됩니다.
6. 2000 rpm (872 x g)에서 10분간 원심분리하고, 2개의 15 mL 원추형 튜브 각각에서 상층액을 조심스럽게 흡입 제거합니다. 참고: 흡입 피펫에 P-200 팁을 부착하여 펠릿에서 가능한 한 많은 Matrigel^®을 제거하도록 합니다.
7. 각 펠릿을 4mL의 Accumax+1X ROCKi로 4회 위아래로 피펫팅하여 재현탁시킨 후, 두 개의 펠릿을 하나의 튜브에 합치십시오(총 8mL의 Accumax+1X ROCKi).
8. 튜브 측면에 4~6회 부딪혀 현탁액을 추가로 재현탁합니다.
9. 튜브를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 10분간 넣습니다. 5분 간격으로 튜브를 꺼내 후드로 옮긴 후, 각 튜브 벽에 8~10회 피펫팅하여 현탁액을 재현탁시킵니다.
10. 튜브를 인큐베이터에 다시 넣고 5분간 두십시오.
11. 인큐베이터에서 튜브를 꺼내 튜브 측면에 대해 8~10회 더 피펫팅합니다.
12. 현미경으로 세포 현탁액 10µL를 관찰하여 단일 세포 분리가 이루어졌는지 확인합니다. 참고: 10분 배양은 일부 작은 덩어리와 함께 단일 세포를 얻기에 충분합니다.
13. 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브로 옮겨 모으십시오.
14. 세포 현탁액이 담긴 50mL 원추형 튜브에 얼음처럼 차가운 1X PBS + 1X ROCKi 25mL를 추가하고 2000rpm 또는 872 x g에서 10분간 원심 분리합니다.
15. 상층액을 제거하고 세포 침전물을 3 mL의 3dGRO^® Human Colon Organoid Expansion Medium (SCM304) + Penicillin/Streptomycin (P/S) + 1X ROCKi에 5 mL 피펫으로 6~8회 위아래로 피펫팅하여 재현탁시킵니다.
16. 세포 계수기(예: Scepter 3.0)에서 세포 수를 측정하기 위해 50µL의 세포를 취합니다.
17. 필요한 경우 세포를 원심 분리합니다. SCM304 + P/S + 1X ROCKi로 세포를 1x10⁶ 세포/mL로 재현탁합니다.
18. 1x10⁶ 세포/mL 및 0.5x10⁶ 세포/mL 농도의 세포 샘플 두 개를 추가로 준비하고 배양 접시에 접종하십시오.
    a. 2x10⁶ 세포/mL 농도의 세포 200µL를 2% GFR Matrigel^®으로 사전 코팅된 인서트 각각에 접종하여 인서트당 400k 세포를 배양하십시오.
    b. 사전 코팅된 2% GFR Matrigel^® 인서트 각각에 1x10⁶ 세포/mL 농도의 세포 200 µL를 접종하여 인서트당 200k를 확보합니다.
    c. 사전 코팅된 2% GFR Matrigel^® 인서트 각각에 0.5x10⁶ 세포/mL 농도의 세포 200 µL를 접종하여 인서트당 100k를 처리합니다.
    
19. 인서트의 기저측 각 웰에 성장 배지 + 1X ROCK 억제제 1000 µL를 첨가합니다.
20. 접시를 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에 넣어 배양합니다.
21. 인서트에 시드된 세포를 현미경으로 매일 관찰하여 단층의 접합 상태를 확인합니다.
22. 시드 1일 후 3D 및 2D 세포 배양용 생사 검출 키트(CBA415)를 사용하여 생사 검출 염색을 수행합니다.
23. 단층 배양이 100%에 도달할 때까지 SCM304+P/S+1X ROCKi로 2일마다 배지를 교체합니다.
24. 단층 배양이 완료되기 하루 전부터 원하는 시점에 도달할 때까지 매일 조직 배양 후드에서 TEER 측정을 수행하십시오. 사용 전 TEER 기기 설정에 대해서는 제조사의 지침을 참조하십시오.

대장 PDO(SCC321) 단일 세포 분해

본 단일 세포 분해 실험에는 Millicell^® 24-well hanging inserts (PTRP24H48)를 사용하였으며, 인서트당 세포 밀도는 2x10⁵ 세포였습니다. 인서트는 1X PBS에 용해된 2% GFR Matrigel^®로 코팅하여 37°C에서 최소 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다. 본 프로토콜은 배양 5일차 대장 환자 유래 오가노이드(PDO)(SCC321)의 50-60 x 10 µL 돔을 기준으로 합니다. TrypLE Express 및 1X PBS와 같은 모든 시약에 1X ROCKi(SCM075)를 첨가하십시오.

1. 냉각된 1X PBS+1X ROCKi 용액에서 P-1000 피펫을 사용하여 Matrigel^® 돔을 여러 번 분리하고 분쇄합니다.
2. 오가노이드 현탁액을 3개의 15mL 원뿔형 튜브(15mL 원뿔형 튜브당 최대 20 x 10 µL 돔)로 옮기고, 현탁액을 측면에 여러 번 부딪혀 Matrigel^® 돔에서 오가노이드를 더 분리합니다. 참고: 60 x 10 µL 돔보다 많은 경우, 추가 15mL 튜브를 사용하십시오.
3. 4°C에서 2000 rpm (872 x g)으로 10분간 원심분리합니다.
4. 상층액을 조심스럽게 흡입 제거하고, 3개의 15mL 원추형 튜브에 담긴 각 펠릿을 5mL의 얼음처럼 차가운 1X PBS+1X ROCKi에 재현탁시킵니다.
5. 2000 rpm (872 x g)에서 4°C로 10분간 원심 분리합니다.
6. 상층액을 조심스럽게 제거하고, 3개의 15mL 원추형 튜브에 각각의 펠릿을 2mL TrypLE Express+1X ROCKi로 재부유시킵니다. 현탁액이 매우 점성이 높으면 TrypLE Express를 더 추가합니다.
7. 37°C 인큐베이터에서 10분간 배양하고, 10분마다 피펫으로 각 튜브의 측면에 여러 번 부딪혀 재현탁합니다.
8. 현미경으로 현탁액 내 단일 세포를 확인합니다. 2-3개 세포로 구성된 소규모 군집만 존재해야 합니다. 오가노이드가 여전히 분해되지 않았다면 37°C에서 배양을 계속하고 5분마다 분해 상태를 확인합니다.
9. 오르가노이드가 분해되면, 세포 현탁액에 냉각된 DMEM/F-12 PLUS 배지(SCM162) + 1X ROCK 억제제 또는 1X PBS + 1X ROCK 억제제 5mL를 첨가합니다.
10. 세포 현탁액을 500 x g에서 5분간 원심 분리합니다.
11. 상층액을 제거하고 세포 펠릿 위에 남아 있는 Matrigel^® 층을 조심스럽게 제거합니다.
12. 세포 펠릿을 성장 배지(SCM105) + 1X ROCK 억제제에 1x105 세포/mL의 농도로 재현탁하고, 세포 덩어리를 분해하기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.
13. 300 µL의 성장 배지에 2x10⁵ 세포/인서트를 시드합니다.
14. 인서트의 기저면 측 각 웰에 배양 배지 + 1X ROCK 억제제 1000 µL를 첨가합니다.
15. 플레이트를 5% CO_2가 있는 37°C 인큐베이터에 넣어 배양합니다.
16. 삽입물에 접종된 세포의 단층 밀집도를 현미경으로 매일 관찰합니다.
17. 시드 1일 후, 3D 및 2D 세포 배양용 생사 생존도 분석 키트(CBA415)를 사용하여 생사 생존도 염색을 수행하십시오.
18. 단층 배양이 100%에 도달할 때까지 SCM304+P/S+1X ROCKi로 2일마다 배지를 교체합니다.
19. 단층 배양이 완료되기 하루 전부터 원하는 시점에 도달할 때까지 매일 조직 배양 후드에서 TEER 측정을 수행하십시오. 사용 전 TEER 기기 설정에 대해서는 제조사의 지침을 참조하십시오.

Millicell^® 인서트 코팅을 위한 GFR Matrigel^® 최적 비율 결정

이 단일 세포 분해 실험에서는 Greiner CELLSTAR^® 24-well plate (M8812)용 1 µm 기공 크기의 Millicell^® 24-well hanging inserts (PTRP24H48)를 사용했으며, 인서트당 (24-well) 세포 밀도는 200k 세포였습니다. 인서트는 1X PBS에 1%, 2%, 4%, 6%, 8% 또는 10% GFR Matrigel^®로 코팅되었습니다.

1. 밀리셀^® 인서트를 코팅하기 위해 얼음처럼 차가운 1X PBS 또는 DMEM/F-12 Plus (SCM162)에 1%, 2%, 4%, 6%, 8% 및 10% GFR Matrigel^®을 준비합니다. 참고: 희석액은 사용 직전까지 얼음에 보관하십시오.
2. 무균 기법을 사용하여 밀리셀^® 행잉 인서트를 블리스터 포장에서 꺼내 24-웰 세포 배양 플레이트에 넣으십시오.
3. 희석된 GFR Matrigel^®을 얼음에서 꺼내 조직 배양 후드로 옮깁니다.
4. 적절한 인서트에 200-400 µL의 희석된 GFR Matrigel^®을 첨가하고, 세포를 시드하기 전에 최소 1시간 동안 37°C 인큐베이터에 두거나 냉장고에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
   a. Millicell^® 인서트에 세포를 시드하기 위해 Accumax를 사용하여 iPSC
   유래 오가노이드(SCC300)를 단일 세포 분해하는 방법은 상기 프로토콜을 참조하십시오. b. Millicell^® 인서트에 세포를 시드하기 위해 TrypLE Express를 사용하여 환자 유래 오가노이드(SCC321)를 단일 세포 분해하는 방법은 상기 프로토콜을 참조하십시오.

밀리셀^® 인서트 상의 오가노이드 유래 단일층에 대한 생사 세포 생존율 염색

1. "스피로이드 및 오가노이드 배양 프로토콜" 섹션에 명시된 3D 및 2D 세포 배양용 생사 세포 생존율 분석 키트(CBA415) 사용 염색 프로토콜을 따르십시오.
2. 습도 조절된 37°C 인큐베이터에서 24-웰 인서트 플레이트를 꺼냅니다.
3. 필터가 부착되지 않은 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫을 사용하여 정점 쪽에서 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 참고: 인서트(단층)의 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
4. 12mL 용액(배지 1:1 1X PBS) 당 칼세인 AM 5µL, 프로피디움 요오드 20µL, 호에스트 33342 8µL를 첨가합니다.
5. 염색 용액을 완전히 혼합하기 위해 보텍스합니다.
6. 인서트의 단층 배양을 1X PBS로 두 번 세척합니다.
7. 세포 단층이 있는 각 인서트에 200-400 µL의 염색 용액을 첨가하고 37°C에서 60분 동안 배양합니다.
8. 염색 용액을 1X PBS로 교체하고 적절한 여기 및 방출 필터를 사용하여 형광 현미경으로 이미지를 촬영합니다.
9. 계속 배양할 세포의 경우 배지로 두 번 세척한 후 신선한 배지로 교체합니다.
10. 접시를 다시 습도 조절된 37°C 인큐베이터에 넣어 배양을 계속하십시오.

Millicell^® 인서트 상에서의 단일층 형성 모니터링

인서트에 시드된 세포를 현미경으로 매일 관찰하여 단일층의 융합도를 확인하고, 단일층이 융합되기 하루 전부터 매일 조직 배양 후드에서 TEER 측정을 시작합니다. 사용 전 TEER 기기 설정을 위해 제조사의 지침을 참조하십시오.

Millicell^® 인서트 상의 단일층 분화

• 단층이 100% 융합에 도달했을 때만 분화를 시작하십시오.
• ENR 분화 배지 조성을 사용하여 단층을 분화시키려면 인서트(정상면)에 300 µL, 웰(기저면)에 1000 µL를 첨가하십시오.

 

• 매체는 이틀에 한 번씩 교체하십시오.
• 실험의 원하는 종결점에 도달할 때까지 매일 또는 격일로 TEER 측정을 계속하십시오.

Millicell^® 인서트 상의 단층 배양 세포에 대한 ICC 염색 및 이미징

1. 원하는 시점에 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 단층을 제거하여 조직 배양 후드에 놓으십시오.
2. 흡입 피펫을 사용하여 각 인서트의 정단면(apical side)과 기저측면(basolateral side, 웰)에서 배지를 흡입 제거하십시오. 팁: 필터가 없는 P-200 팁을 흡입 피펫 끝에 부착하거나 마이크로피펫을 사용하여 정단면과 기저측면에서 배지를 천천히 흡입 제거하십시오. 이 단계 및 이후 단계에서 인서트의 막 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
3. 0.4mL의 1X PBS로 정단면을, 1mL의 1X PBS로 기저측면을 각각 한 번씩 세척합니다.
4. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫으로 정점 및 기저측면에서 1X PBS를 천천히 흡입 제거하십시오.
5. 각 24-웰 인서트를 1X PBS에 용해된 4% 파라포름알데히드 0.4mL로 실온에서 30분간 고정합니다.
6. P-1000 피펫으로 4% 파라포름알데히드를 제거하고 적절히 폐기하십시오.
7. 첨단면은 0.4mL, 기저측면은 1mL의 1X PBS로 두 번 세척합니다.
8. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫으로 정단 및 기저 측면의 1X PBS를 천천히 흡입 제거합니다.
9. 각 단층을 1X PBS에 용해된 0.3% Triton-X-100 + 1% BSA 용액 200-400 µL로 15분간 투과 처리합니다.
10. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫을 사용하여 정단면에서 천공화 용액을 천천히 흡입 제거합니다.
11. 차단 용액(1X PBS + 5% 일반 당나귀 혈청 + 1% BSA) 0.4mL를 실온에서 1시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 첨가합니다.
12. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫을 사용하여 정단면에서 차단 완충액을 천천히 흡입 제거합니다. 이 과정에서 인서트 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
13. 1차 비결합 또는 결합 항체 0.2-0.4 mL를 희석 완충액(1X PBS 내 1% BSA)에 용해하여 실온에서 2-4시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어 주면서 인서트를 염색합니다.
14. P-1000 피펫으로 각 인서트마다 팁을 교체하며 염색 용액을 제거합니다.
15. 각 인서트를 1X PBS로 5분씩 3회 세척합니다.
16. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫으로 정점 측의 1X PBS를 천천히 흡입하여 제거합니다. 이 과정에서 인서트 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
17. 필요한 경우, 희석 완충액(1X PBS에 1% BSA)에 적절한 2차 항체를 사용하여 실온에서 2~3시간 또는 4°C에서 하룻밤 동안 흔들어 주면서 인서트를 염색합니다.
18. 각 인서트를 1X PBS로 5분씩 3회 세척합니다.
19. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫을 사용하여 정점면에서 1X PBS를 천천히 흡입 제거하십시오. 이 과정에서 인서트 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
20. 실온에서 15분간 1X PBS에 용해된 2-10 µg/mL 농도의 DAPI 용액 0.2-0.4 mL로 대조 염색합니다.
21. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫을 사용하여 정단면에서 DAPI 용액을 천천히 흡입 제거합니다. 이 과정에서 삽입물의 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
22. 1X PBS로 한 번 세척합니다.
23. 필터가 없는 P-200 팁이 부착된 흡입 피펫으로 정단면에서 1X PBS를 천천히 흡입 제거합니다. 이 과정에서 인서트 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
24. 첨단면에 1X PBS 0.4mL를, 기저 측면에 1X PBS 1mL를 첨가합니다. 4°C에서 보관하십시오.
25. 플레이트에서 인서트를 직접 촬영하거나, 인서트를 조심스럽게 잘라내어 유리 바닥 플레이트에 장착합니다.

PDO 및 고분극성 PSC 유래 오가노이드 단일층 워크플로우 최적화

밀리셀^® 인서트 코팅 및 시드 배양을 위한 팁과 요령

• 흡입 피펫의 팁에 필터가 없는 P-200 팁을 부착하거나 P-200 피펫을 사용하여 인서트에서 PBS를 천천히 흡입 제거하십시오. 인서트 표면을 긁지 않도록 주의하십시오.
• GFR Matrigel^® 농도는 모델 시스템에 따라 최적화해야 할 수 있습니다. 막 표면에 3차원 구조가 형성되면 Matrigel^® 비율을 줄이는 것을 고려하십시오.
• 배양 중 세포 생존율을 높이기 위해 분해 시약에 10 µM ROCK 억제제를 첨가하십시오(상기 분해 프로토콜 참조).
• 단일 세포 현탁액을 200k 세포/24-웰 인서트에 접종하여 3-4일 내에 완전한 단일층을 형성하도록 합니다.
• Greiner 24-well 배양 플레이트(M8812) 내 Millicell^® 24-well 인서트의 정점측(apical side)에는 300 µL, 기저측(basolateral side)에는 1000 µL를 사용하십시오. 최적의 기저측 용량은 플레이트 브랜드에 따라 다릅니다. 권장 배지 용량에 대한 자세한 내용은 Millicell^® 인서트 사용자 가이드에서 확인할 수 있습니다.