프로토콜 가이드: 정점-외부 위장관 오가노이드 생성

• Apical-Out 오가노이드
• Apical-Out 오가노이드 생성 프로토콜
• Apical-Out 오가노이드의 면역형광 염색
• 정점-외부 오가노이드의 냉동 보존
• 오가노이드 장벽 무결성 분석 프로토콜
• H. pylori를 이용한 아피컬-아웃 위 오가노이드 감염
• 제품 및 카탈로그 번호

정점-외부 오가노이드

줄기세포 유래 오가노이드는 점막의 정상 및 병리 상태를 연구하는 데 점점 더 중요한 모델이 되고 있다. 장 오가노이드는 장 상피의 여러 핵심 기능을 보존하는데, 여기에는 장벽 무결성, 극성 분비 및 흡수, 선천성 면역 반응, 다계통 분화 능력 등이 포함된다. 그러나 기저막 추출물(BME)을 사용하는 전통적인 3차원 배양법은 "아피칼-인(apical-in)" 표현형을 생성하여 상피의 내강 내면 접근을 어렵게 합니다. 이러한 내부 아피칼 세포 유형을 조사하기 위해 고급 미세주입 기술이 사용되어 왔으나, 이는 고효율 분석이나 이미징에 적합하지 않습니다. 최근 연구에서는 3D 오가노이드의 극성을 반전시켜 "정극 외부(apical-out)"로 만드는 프로토콜을 제시하였다^.¹ 정극 외부 오가노이드는 세포의 내강 구획 분석을 용이하게 하며, 위장관 건강, 약물 스크리닝, ADME/독성 연구 및 질병 연구에서 오가노이드 활용 가능성을 확장한다. 머크 연구팀은 이 배양 프로토콜을 따라 상피세포가 바깥을 향하는 위, 회장, 결장 환자 유래 오가노이드(PDO)를 성공적으로 생성했으며, 위 오가노이드와 헬리코박터 파일로리(H. pylori)의 공배양을 구축하여 숙주/병원체 상호작용 모델을 구축했습니다.

정점-외부 오가노이드 생성 프로토콜

1. 표준 오가노이드 프로토콜에 따라 L-WRN 배양액(SCM105)과 같은 성장 배지에서 오가노이드를 배양한 후, Matrigel® 기저막 돔에서 4-5일간 추가 배양합니다.
2. 돔을 분리하고 넓은 구경의 피펫 팁을 사용하여 5 mM EDTA(E9884)를 함유한 Ca²⁺ 및 Mg²⁺가 없는 PBS(BSS-1006)에 4°C에서 1시간 동안 회전 플랫폼에서 용해시킵니다.
3. 오가노이드 현탁액을 4°C에서 200 x g로 3분간 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 잔여 기저막이 완전히 제거되도록 주의하십시오.
4. 펠릿화된 오가노이드를 Costar® 초저부착 조직 배양 플레이트(CLS3473)에 L-WRN 컨디셔닝 배지(SCM105)와 같은 성장 배지로 재현탁합니다.
5. 37°C, 5% CO₂ 조건에서 72시간 배양합니다.
6. 현미경으로 오가노이드를 관찰하여 외반(eversion)을 확인하십시오. 첨단(apical)이 바깥을 향한 오가노이드는 후속 응용에 사용하거나 초저부착 배양 플레이트의 배지에서 최대 2주 동안 유지할 수 있습니다.

정점-외부 방향 오가노이드의 면역형광 염색

면역형광염색은 확립된 프로토콜 가이드인 '항체를 이용한 전체 마운트 오가노이드의 면역형광염색'에 따라 수행되었다.

정점-외부 방향 오가노이드의 냉동 보존

1. 위 단계에 따라 L-WRN 배양액(SCM105)과 같은 오가노이드 배양액으로 정점 외부 오가노이드를 현탁 배양하여 1-3일간 배양합니다.
2. 오가노이드를 회수하고 4°C에서 200 x g로 3분간 원심분리하여 침전시킨다.
3. 오르가노이드를 신선한 완전 오르가노이드 배양 배지에 10% v/v DMSO(D2650)를 첨가하여 재현탁시킵니다.
4. 바이알을 Mr. Frosty™ 용기에 넣어 -80°C에서 밤새 서서히 동결합니다. 바이알을 액체 질소로 옮깁니다.
5. 오르가노이드를 회수하려면 37°C에서 신속히 해동합니다. 오르가노이드 배지에 재현탁하여 원하는 분석을 위해 배양합니다.

오가노이드 장벽 무결성 분석 프로토콜

1. 위 단계에 따라 L-WRN 배양액(SCM105)과 같은 오가노이드 배양액으로 정점(apical)이 바깥을 향하도록 현탁 배양하여 1-3일간 배양합니다.
2. 오가노이드를 수집하고 4°C에서 200 x g로 3분간 원심분리하여 침전시킨다. 2 mg/mL TRITC-덱스트란(T1037)이 포함된 오가노이드 배양 배지로 시료를 재현탁시킨다. 장벽이 파괴된 대조군을 위해, 대조군 오가노이드를 2 mM EDTA(E9884)를 함유한 핸크 균형 염분 용액(Ca²⁺ 또는 Mg²⁺ 없음)(BSS-1006)에 재현탁하고 얼음 위에서 15분 동안 배양합니다.
3. 오가노이드를 공초점 현미경에 적합한 챔버 슬라이드로 옮긴 후 즉시 적절한 채널에서 이미징하여 명시야 및 형광 이미지를 획득합니다.

H. pylori를 이용한 정점-외부 위 장기유사체 감염

1. 위 단계에 따라 정점 외부 방향 오가노이드를 L-WRN 배양액(SCM105)과 같은 오가노이드 배양 배지로 현탁 배양하여 1-3일간 배양합니다.
2. 초저부착 플레이트에서 72시간 배양 후, H. pylori 균주 26695(ATCC Cat. 700392)를 감염 다중도(MOI) 100으로 오가노이드에 감염시킵니다. 감염 전, 10% FBS(F2442)를 보충한 Brucella Broth(B3051)에서 H. pylori를 37°C에서 18시간 동안 교반 배양합니다.
3. 감염 24시간 후, 오가노이드를 회수하여 PBS로 5분간 세척한 후 4°C에서 200 x g로 5분간 원심분리하여 침전시킨다. 이 과정을 두 번 더 반복한다.
4. 오르가노이드를 4% PFA로 30분간 고정하고 PBS로 세척한 후, 프로토콜 가이드: 항체를 이용한 전체 오르가노이드의 면역형광 염색을 사용하여 항체로 염색합니다.
5. 공초점 현미경으로 오가노이드를 촬영합니다.