다중 실시간 중합효소 연쇄반응(qPCR) 프로토콜

PCR 기술 프로토콜 목차

정량적 PCR 프로토콜

정량적 PCR은 기존 PCR과 동일한 기본 개념을 사용하지만, 증폭 산물이 일반적으로 더 작고 추가적인 염료 또는 표지된 프로브나 프라이머를 사용하여 간접적으로 검출된다는 점에서 반응이 다릅니다.

PCR 기술 가이드에서는 qPCR 실험에 필요한 구성 요소와 품질 관리 요구 사항을 상세히 설명했습니다. 이를 고려하여, 최대 4개의 검출 프로브를 포함하는 qPCR의 기본 템플릿으로 사용할 수 있는 프로토콜을 다음과 같이 제시합니다. 이 반응에서는 프라이머와 프로브를 최종 농도 200 nM로 포함하고 LuminoCt^® ReadyMix를 사용하여 실행합니다. 그러나 다중 검사는 최적화가 필요하며, 각 검사를 순차적으로 다중 검사에 추가하여 조합을 테스트하는 것이 좋습니다. 각 단일 검사에 대한 상세한 검사 최적화 프로토콜은 '프라이머 농도 최적화' 및 '온도 구배를 이용한 프라이머 최적화'에 설명되어 있습니다.

장비

• 정량적 PCR 장비
  
• 마이크로 원심 분리기
  
• PCR 설정용 층류 후드 (선택 사항)

소모품

• DNA/cDNA 템플릿: 중간에서 높은 발현량의 표적 검출을 위해 cDNA 반응액을 1:10으로 희석하거나, 희귀 전사체의 경우 1:2에서 1:5로 희석합니다. 10 ng에서 100 ng의 gDNA.
  
• LuminoCt^® ReadyMix™ (L6669).
  
• PCR 등급 물: PCR 등급 물(W1754 또는 W4502)을 20mL 분량으로 분할하여 냉동 보관하고, 각 반응마다 새로 분할한 물질을 사용하십시오.
  
• 포워드 및 리버스 프라이머 농축 저장액 (100 μM 작업 저장액은 멀티플렉스 반응에 사용하기 적합함).
  
• 특정 표적 검출 프로브(6장 참조) 농축 저장액(100 μM 작업 저장액은 다중 반응에 사용하기에 적합함).
  • 맞춤형 올리고는 여기서 주문할 수 있습니다.
• 멸균 필터 피펫 팁
• 멸균 1.5mL 나사식 마이크로센트리퓨지 튜브 (CLS430909)
  
• PCR 튜브 및 플레이트, 원하는 형식에 맞게 선택하십시오:
  • 개별 얇은 벽 200 μL PCR 튜브 (Z374873 또는 P3114)
  • 플레이트 - 96-웰 플레이트
  (Z374903)
  - 384-웰 플레이트 (Z374911)
  • 플레이트 밀봉재
  - ThermalSeal RTS™ 밀봉 필름 (Z734438)
  - ThermalSeal RT2RR™ 필름 (Z722553)

방법

1. 모든 반응 성분을 얼음 위에서 해동하되, 프로브가 빛에 노출되지 않도록 주의하십시오.
   
   
2. 시료와 대조군을 중복으로 실행할 수 있도록 필요한 반응 횟수를 계산하십시오. 두 개의
   템플릿 없음 대조군(NTC)을 포함하십시오.
   
   
3. 표 P6-13A 및 13B를 기준으로 프로브 혼합물과 프라이머 혼합물을 준비하십시오. 2개 또는 3개의 프로브가 필요한 반응의
   경우, 총 부피(PCR 등급 물 포함)로 조정하십시오. 프라이머
   농도를 최적화한 후, 프라이머 농도/부피를 그에 맞게 조정하십시오. 표 P6-13A
   및 13B에 명시된 부피는 250회 반응 실행에 충분하며, 더 많은 반응을 위해 그에 맞게 증량하십시오.

4. 표 P6-14에 따라 모든 반응에 사용할 마스터 믹스를 준비합니다(각 반응의 부피를 계산하고 피펫팅 오차를 고려하여
10%를 추가하십시오). 기포가 생기지 않도록 잘 혼합합니다.

5. NTC 반응 튜브에 물 5 μL를 첨가합니다.

6. 적절한 튜브/웰에 cDNA/gDNA 용액 5 μL를 첨가합니다.

7. 4단계에서 남은 템플릿 마스터 믹스 15μL를 PCR 튜브에 분주합니다.

8. 튜브를 캡으로 덮거나 PCR 플레이트를 밀봉하고 라벨을 부착합니다(기기 요구사항에 따라). (라벨링이 기기의
여기/검출 광로를 가리지 않도록 주의하십시오.)

9. 간단히 원심분리하고 모든 튜브/웰의 바닥에 올바른 부피의 시료가 있는지 육안으로 확인합니다.

10. 2단계 프로토콜(표 P6‑15)에 따라 시료를 실행하며, 1~2단계를 40사이클 동안 반복합니다.
(참고: 이 조건은 FAST 사이클링 프로토콜에 특화된 것입니다).

11. 스콜피온^® 프로브(Scorpions^® Probes) 또는 분자 비콘(Molecular Beacons)이 포함된 반응의 경우, 3단계 프로토콜(표 P6‑16)을 사용하면 더 효율적이고 민감한 검출이 가능할 수
있습니다. 이 프로토콜을 채택할 경우, 2단계의 어닐링 온도를
최적화할 수 있습니다. 1~3단계를 40회 반복합니다.