범용 SYBR Green qPCR 프로토콜
그림 1.기술 개요: SYBR Green qPCR
정량 PCR에서는 PCR의 각 사이클에서 DNA 증폭을 모니터링합니다. DNA가 로그 선형 증폭 단계에 있을 때 형광의 양은 배경보다 증가합니다. 형광을 측정할 수 있게 되는 지점을 정량화 주기(Cq) 또는 교차점이라고 합니다. 알려진 양의 표준 DNA를 여러 번 희석하여 Cq에 대한 로그 농도의 표준 곡선을 생성할 수 있습니다. 그런 다음 미지의 샘플에 있는 DNA 또는 cDNA의 양을 Cq 값으로부터 계산할 수 있습니다.
A) 반응의 여러 단계 :
기준선: 템플릿의 초기 농도가 낮기 때문에 형광 강도가 너무 낮아 검출되지 않고 배경 신호만 나타납니다.지수: 목표 수율이 빨간색 임계선으로 표시된 검출 임계값에 도달하면 지수 단계를 통해 반응의 진행 과정을 따라갈 수 있습니다.선형: 주형의 농도가 증가함에 따라 사용 가능한 DNA 중합효소 농도가 감소하고 반응 속도가 감소합니다.
고원: 증폭을 계속하기에 유리 효소가 충분하지 않아 이 시점 이후에는 반응이 최대 수율 또는 고원 단계에 도달합니다.
B) 개별 반응은 형광이 처음으로 역치 이상으로 상승하는 주기가 특징이며, 이를 정량 주기(Cq)라고 합니다. 시작 물질이 풍부하면 초기 주기에 증폭이 관찰되고 Cq가 더 낮아집니다. 시작 물질이 부족하면 이후 주기에 증폭이 관찰되고 Cq가 더 높아집니다. 형광, Cq, 증폭된 산물의 양 사이의 이러한 상관관계는 넓은 동적 범위에서 템플릿의 정량화를 가능하게 합니다.
실시간 PCR은 상대 연구에도 적합합니다. 각 영역에 고유한 프라이머를 사용하여 증폭하고 다른 형광 염료로 태그를 지정하여 반응을 수행할 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 여러 정량 열 사이클러에는 여러 검출 채널이 포함되어 있습니다. 이 멀티플렉스 시스템에서는 표적 DNA/cDNA의 양을 하우스키핑 시퀀스(예: GAPDH 또는 β-actin)의 양과 비교할 수 있습니다.
NR= 권장하지 않음
X= 권장
XX= 선호 방법
분석 고려 사항
DNA 준비
PCR의 성공을 보장하는 가장 중요한 단계는 고품질의 DNA 준비입니다. DNA 템플릿의 무결성과 순도가 필수적입니다. 정량적 PCR은 여러 차례의 효소 반응을 포함하므로 단백질, 페놀/클로로포름, 염분, EDTA 및 기타 화학 용매와 같은 불순물에 더 민감합니다. 오염 물질도 형광 감지를 방해할 수 있습니다. 260nm와 280nm에서의 흡광도 값의 비율을 통해 DNA 순도를 추정할 수 있습니다. 순수한 DNA의 A260/A280 비율은 1.8-2.0입니다. 이 비율이 낮을수록 단백질과 같은 오염 물질이 존재함을 나타냅니다.
템플릿
qPCR을 시작하려면 표적 핵산 사본(약 100pg의 gDNA 또는 cDNA에 해당)이 매우 적게 필요합니다. 반응 억제제에 의한 오염을 최소화하려면 정확한 정량화를 위해 시작 템플릿 양을 최소로 유지해야 합니다. 시작 물질이 RNA인 경우 프라이머 설계와 DNase I 처리를 통해 gDNA 오염으로 인해 생성될 수 있는 신호를 줄일 수 있습니다.
프라이머 설계
dsDNA 결합 염료 또는 프로브 기반 검출 화학을 사용하든, 고품질 프라이머 설계는 qPCR에서 가장 중요한 사전 실험 단계 중 하나입니다. 프라이머-이합체 및 이차 구조로 인한 합병증을 제거하기 위해 프라이머 설계 소프트웨어를 사용하여 PCR용 특정 프라이머를 설계해야 합니다. 프라이머 농도가 낮을수록 프라이머-이합체 형성 및 비특이적 제품 형성의 축적이 감소하며, 이는 정량 PCR에서 SYBR Green I 염료를 사용하는 데 중요합니다.
dNTP
표준 PCR/qPCR 마스터믹스에는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 포함되어 있습니다. 그러나 일부 혼합물은 dTTP를 dUTP로 대체할 수 있습니다. 이전 반응에서 dUTP로 실행한 제품에는 티민 대신 우라실이 포함됩니다. 그러면 우라실-DNA-글리코실라아제(UNG)에 의해 절단되기 쉽습니다. 따라서 후속 반응을 UNG로 미리 배양하면 반응 간 이월 오염을 방지할 수 있습니다. 실험실의 모든 반응은 dUTP를 사용해야 합니다.
마그네슘 농도
마그네슘 염화물(MgCl2)은 역전사효소, Taq DNA 중합효소 및 Taq DNA 5' ~ 3' 엑소뉴클레아제 활성에 필요합니다. DLP를 포함하는 반응에 대한 최적의 Mg2+ 농도는 일반적으로 3~6mM입니다. 염화마그네슘 농도가 낮을수록 일반적으로 비특이적 생성물이 더 적게 형성됩니다. 일부 레디믹스 용액은 염화마그네슘 7mM(최종 농도 3.5mM)의 2배 농도로 제공됩니다. 경우에 따라 필요한 경우 최종 염화마그네슘 농도를 더욱 최적화하기 위해 25mM 염화마그네슘 용액 바이알이 제공됩니다. 예를 들어 전갈 프로브 검출을 사용하는 경우와 같이 낮은 농도를 사용할 수 있도록 MgCl2가 포함되지 않은 반응 혼합물이 필요할 수 있습니다.
역전사효소
고온에서 활성을 유지하면서 높은 수율의 cDNA를 제공하는 역전사효소는 RT-qPCR의 성공에 매우 중요합니다. 고온에서의 성능은 중요한 이차 구조를 가진 RNA 영역이 불안정해져 혼성화 및 후속 증폭을 위해 접근할 수 있도록 도와줍니다. 1단계 RT-qPCR을 수행할 때 고온 성능은 높은 용융 온도(Tm)를 가진 유전자 특이적 프라이머를 사용할 수 있게 하여 반응 특이성을 높입니다. 2단계 프로토콜을 수행할 때는 효소가 RNA에서 선형적이고 비례적인 cDNA 수율을 생성하는지 확인하는 것이 중요합니다. 피펫팅을 최소화하면 변동성을 줄일 수 있습니다. 일부 ReadyMix에는 RT 수행에 필요한 프라이머 및 기타 시약(예: ReadyScript® cDNA 합성 혼합(RDRT)이 포함되어 있습니다.
Taq DNA 폴리머라제
RT에 가장 적합한 역전사효소를 선택하는 것과 마찬가지로 적절한 효소를 선택하는 것이 중요합니다. 천연 Taq DNA 중합효소의 근본적인 문제는 효소가 저온에서 잔류 활성을 갖는다는 것입니다. 비특이적 프라이머 결합은 이러한 잔류 중합효소 활성의 결과로 비특이적 생성물 형성으로 이어집니다. 항체 차단 또는 화학적으로 차단된 Taq DNA 중합효소('핫 스타트')는 고온 변성 단계가 시작될 때까지 효소 활성을 방지하여 이러한 상황을 바로잡는 데 도움이 됩니다. 용도에 가장 적합한 핫스타트 중합효소를 정의하려면
기기 유형별 내부 기준 염료
일부 실시간 PCR 열 사이클러는 광학 시스템의 변동성을 제어하고 신호 강도의 차이를 표준화하기 위해 ROX와 같은 로딩 염료가 필요합니다. 마찬가지로 일부 열 사이클러는 SYBR Green I 염료 분석(배경이 매우 낮음)으로 작업할 때 가상 배경을 생성하기 위해 플루오레세인이 필요합니다. 이러한 염료는 적절한 농도를 사용할 수 있도록 ReadyMix 또는 별도의 구성 요소로 제공될 수 있습니다. 경우에 따라 반응 정규화를 위해 내부 기준 염료 바이알이 포함되어 있는 경우도 있습니다. 이 염료의 최대 여기량은 586nm이고 최대 방출량은 605nm입니다. ROX 기준 염료의 표준 기기 설정은 내부 기준 염료의 측정에 적합합니다. 이 내부 기준 염료는 ABI 시퀀스 검출 시스템에 필요합니다.
인스트루먼트
인스트루먼트와 호환되는 시약을 선택해야 합니다. 플랫폼마다 서로 다른 정규화 염료를 사용하므로 호환되는 정규화 염료가 있는 시약을 선택해야 합니다(부록 1 참조).
예를 들어 384웰 플레이트의 자동 로딩을 사용하는 ABI 7900의 높은 처리량과 단일 48웰 플레이트를 지원하는 Illumina Eco 기기를 대조하는 등, 많은 qPCR 기기가 특정 범위의 애플리케이션을 지원하도록 설계되었습니다. 가장 적합한 기기가 연구의 요구 사항을 충족합니다. 가장 바람직한 기능을 수행하고 다운스트림 통계 분석 소프트웨어 패키지에서 쉽게 조작할 수 있도록 데이터 출력 측면에서 유연성을 갖춘 사용자 친화적인 소프트웨어가 포함된 기기를 선택하는 것이 바람직합니다. 따라서 직원 교육과 결과 생성에 필요한 시간을 단축할 수 있습니다. 필요한 추가 기능으로는 절대적으로 균일한 PCR 블록(96개 웰의 복제에 걸쳐 절대 최대 편차 1Cq = 2배)과 광범위한 파장에 걸쳐 가능한 한 민감하고 균일하게 방출을 여기 및 감지하는 광학 시스템이 있습니다. 이를 통해 다양한 형광체를 선택할 수 있고 멀티플렉싱이 가능합니다. 고려해야 할 다른 기능으로는 표준 마이크로시터 플레이트가 반응에 사용되지 않는 경우와 같이 특정 소모품과 관련된 운영 비용과 비표준 형식의 플레이트/튜브를 로드하는 편의성 등이 있습니다.
컨트롤
양성 컨트롤은 모든 키트 구성 요소가 제대로 작동하는지 확인하는 데 항상 유용합니다. 오염 여부를 확인하려면 템플릿 없음/음성 대조군이 필요합니다. 템플릿 없음 컨트롤의 신호는 DNA 오염 또는 프라이머 이량체 형성의 존재를 나타냅니다.
Buffer
버퍼 또는 반응 마스터믹스에는 일반적으로 dNTP, Taq DNA 중합효소, MgCl2 및 안정제가 포함되어 있습니다. 검출 화학, 기기 및 반응 요건에 따라 SYBR Green I, ROX™, 플루오레세인 및 불활성 로딩 염료도 포함될 수 있습니다. PCR 버퍼 구성 요소와 안정제는 일반적으로 제조업체의 독점 제품입니다. 개별적으로 구매하면 각 성분을 개별적으로 반응에 최적화할 수 있으므로 최대한의 유연성을 확보할 수 있습니다. 그러나 반대로 마스터믹스로 재료를 함께 구매하면 유연성은 떨어지지만 배치 일관성과 편의성이 향상되고 피펫팅 단계가 줄어들어 오류와 오염 가능성이 줄어듭니다.
데이터 분석
정량적 SYBR Green PCR을 수행하는 데 사용되는 실시간 기기의 권장 사항을 따르세요. 다음은 새로운 기기 사용자에게 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 사이클 수는 형광에 대해 플롯됩니다. 각 샘플의 템플릿 양을 결정하기 위해 임계값 사이클(CTs) 또는 교차점이 사용됩니다. 임계값 주기 또는 교차점은 PCR 산물의 형성으로 인해 형광이 감지 가능하게 증가하는 첫 번째 주기를 말합니다. 교차점 이전의 사이클이 기준 사이클입니다. 기준 주기는 PCR 산물로 인한 형광 증가를 감지할 수 없습니다. 형광의 첫 번째 검출 가능한 증가가 발생하는 시점을 결정하는 데 사용되는 임계값은 수동으로 조정할 수도 있습니다. 임계값은 항상 로그 증폭 플롯에서 수행해야 합니다. 로그 증폭 플롯에서 임계값은 고원 단계가 아닌 로그 선형 범위에서 설정해야 합니다.
용융 곡선
실행 마지막에 용융 곡선 분석을 수행하면 관심 있는 PCR 산물만 분석하는 데 도움이 됩니다. 실시간 기기 제조업체의 용융 곡선 분석 지침을 따르세요. 동일한 프라이머를 사용한 연속 실행은 이미 결정된 이합체와 제품 용융 온도 사이에 온도가 있어야 하는 추가 사이클링 단계에서 데이터를 수집하여 제품 신호에 대한 프라이머 이합체 형성의 기여도를 제거하도록 수정할 수 있습니다(TMs).
정량화 방법
표준 곡선
표준 곡선은 절대 및 상대 정량화 모두에 필요합니다. 표준 곡선을 생성할 때는 서로 다른 농도의 DNA(일반적으로 5개)를 사용하여 미지의 농도를 괄호로 묶는 표준 곡선을 생성해야 합니다. 각 농도는 중복으로 실행해야 합니다.
절대 및 상대 정량
이 SYBR Green PCR 키트는 절대 또는 상대 정량화를 사용하여 표적 DNA를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 절대 정량 기술은 초기 샘플에서 표적 DNA의 양을 결정하는 데 사용되는 반면 상대 정량 기술은 표적 DNA의 양과 기준 앰플리콘 사이의 비율을 결정합니다. 이상적인 기준 앰플리콘은 불변의 구성적 발현을 갖는 것입니다. 실제로는 이 기능을 위해 하우스키핑 유전자가 선택되지만 위의 요구 사항에 더 잘 부합하는 다른 참조 선택이 있습니다.1
절대 정량화는 외부 표준을 사용하여 관심 있는 표적 핵산의 절대량을 결정합니다. 어닐링으로 인한 정량화 차이를 제거하려면 외부 표준의 프라이머 결합 부위가 표적 서열의 프라이머 결합 부위와 동일해야 합니다. 이상적인 외부 표준은 표적 서열과 동일하거나 표적 서열과 약간만 다른 서열을 포함합니다. 절대 정량화를 위해서는 표적과 외부 표준 간의 증폭 효율이 동등해야 합니다. 적합한 구조 또는 증폭기가 확인되면 외부 표준 희석의 표준 곡선을 생성하여 미지의 표적 샘플의 농도를 결정하는 데 사용합니다.
상대 정량법을 사용하면 샘플에서 표적 템플릿과 기준 템플릿의 양 사이의 비율을 계산할 수 있습니다. 이 방법은 변하지 않을 것으로 추정되는 대조군과 비교하여 표적의 양을 측정하기 때문에 상대 qPCR은 예를 들어 조직 간 또는 건강한 샘플과 질병 샘플 간의 유전적 다형성 차이를 측정하는 데 가장 자주 사용됩니다. 이 기술의 장점은 내부 표준을 사용하면 샘플 준비 및 취급의 변동을 최소화할 수 있다는 것입니다. SYBR 시스템을 사용할 때는 표적과 내부 기준 정량화를 별도의 반응에서 실행해야 합니다.
상대 정량의 정확도는 표준을 위한 기준 템플릿의 적절한 선택에 따라 달라집니다. 표준물질의 가변성은 결과에 영향을 미치므로 표준물질이 적절해야 합니다.1 일부 연구자들은 표준 곡선을 실행하지 않고 목표 수량을 기준의 일부분으로 보고하는데, 이를 비교 정량법이라고 합니다. 또는 표적과 기준의 증폭 효율이 무시할 수 있는 수준이라고 가정하고 기준 서열에 대해 결정된 표준 곡선만을 기준으로 표적을 정량화할 수도 있습니다. 마지막으로, 가장 정확한 상대 정량화 기법에서는 기준과 표적 모두의 증폭 효율을 측정하고 보정 계수를 결정합니다. 정규화라고 하는 이 과정에는 알려진 농도의 표적과 기준이 모두 포함된 샘플과 두 개의 표준 곡선이 필요합니다.
PCR 반응 효율 결정
기준 샘플과 표적 샘플 간의 PCR 효율은 각 표적에 대한 희석 시리즈를 준비하여 결정합니다. 기준의 CT 값은 표적에서 차감되고 이 CT 값의 차이는 템플릿 양의 로그에 대해 플롯됩니다. 결과 직선의 기울기가 ± 0.1보다 작으면 증폭 효율이 비슷한 것으로 판단됩니다.
장비
- 정량 PCR 기기
- 미세 원심분리기
- PCR 셋업용 층류 후드(옵션)
공급품
- qPCR SYBR 그린 믹스 - qPCR 선택 가이드 참조 (1부 및 2부)
- DNA/cDNA 템플릿- cDNA 반응 희석 1:중간에서 고도로 발현된 표적을 검출하려면 10, 또는 1:2에서 1:5 또는 희귀 전사체의 경우 10ng ~ 100ng gDNA
- 작업 농도로 희석된 정방향 및 역방향 프라이머(대부분의 분석에는 10µM 작업 재고로 충분)
- 사전 설계된 유전자 발현 프라이머도 대부분의 모델 유기체에 사용할 수 있습니다(KiCqStart® 및 SYBR® 그린 프라이머, KSPQ12012)
- 멸균 필터 피펫 팁
- 멸균 1.5mL 스크류탑 마이크로원심분리기 튜브(예: CLS430909)
- PCR 튜브, 원하는 형식에 맞는 튜브를 선택합니다:
- PCR 등급 용수(W1754)
프로토콜
준비
- 모든 반응 성분을 얼음 위에 놓습니다.
- 혼합한 다음 간단히 원심분리하여 튜브 바닥의 내용물을 수집합니다.
표준 SYBR 녹색 I 염료 반응
주: 기존 PCR보다 높은 프라이머 농도를 사용할 때 KiCqStart ReadyMix에서 실행되는 분석이 최적임을 관찰했습니다. 아래 프로토콜에서는 여러 독립적인 분석에서 최적의 농도로 관찰된 최종 농도인 450 nM을 사용합니다.
1. 모든 샘플을 중복으로 실행할 수 있는 충분한 마스터 믹스를 준비합니다.
a. 템플릿 네거티브 컨트롤(NTC)을 중복으로 포함해야 합니다.
b. 선택한 qPCR 시약에 따라 아래 표에서 적절한 시약을 선택합니다.
c. 혼합할 시약의 양을 계산합니다. 피펫팅 오류를 위해 10% 부피를 추가합니다.
d. 기포가 생기지 않도록 잘 섞습니다.
키큐스타트 시약용 마스터 믹스:
기타 완전한 qPCR 레디믹스를 위한 마스터 믹스:
별도 구성품이 포함된 qPCR 시약용 마스터 믹스:
1최적의 MgCl2농도는 1mM에서 6mM까지 다양합니다.2사용하는 기기에 맞는 최적의 기준 염료 농도를 결정하려면 <부록 1 을 참조하십시오.
2. 반응 설정:
a. NTC 반응의 경우, 반응 튜브에 4μL의 물을 추가합니다.
b. 실험용 반응의 경우, 반응 튜브에 4μL의 cDNA 용액을 추가합니다.
c. 모든 튜브를 짧게 원심분리합니다. 모든 튜브 또는 웰의 바닥에 정확한 양의 샘플이 들어있는지 육안으로 확인합니다.
d. 템플릿 마스터 혼합물 16μL를 각 qPCR 튜브 또는 플레이트 웰에 조심스럽게 분주합니다.
e. 반응을 잘 섞고 필요한 경우 회전합니다.
f. 튜브를 뚜껑을 덮거나 PCR 플레이트와 라벨을 밀봉합니다(기기 요구 사항에 따라). (라벨이 기기의 여기/검출 광 경로를 가리지 않는지 확인합니다.)
3. 기기 제조업체 권장 사항에 따라 샘플을 실행합니다. 표준 및 고속 사이클링의 예가 아래에 포함되어 있습니다.
표준 사이클링 파라미터:
빠른 사이클링 매개변수:
문제 해결 가이드
자료
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