세포 배양 오염 문제 해결
배양 오염: 개요
'세포 배양 오염'이라고 하면 일반적으로 세포와 탁한 배지 사이의 박테리아를 떠올리지만, 배양 플라스크의 원치 않는 침입자는 다양한 형태로 나타날 수 있습니다. 바이러스 및 화학 오염 물질도 배양 건강에 상당한 영향을 미칠 수 있으며, 세포주가 교차 오염되지 않도록 하는 것은 결과의 재현성을 위해 매우 중요합니다.
세포 오염은 얼마나 만연해 있을까요? FDA, ATCC 등의 연구에 따르면 오늘날 모든 세포 배양의 5~30%가 마이코플라스마 종으로만 오염된 것으로 추정됩니다. 한 연구에서는 일반 세포주의 바이러스 오염 발생률이 25%를 초과했으며5, 비세포성 바이러스는 배양 상태가 그 존재에 대한 단서를 제공하지 못할 수 있으므로 마이코플라즈마보다 검출을 피할 가능성이 훨씬 더 높습니다.
그림 1.세포 오염
특정 오염 물질을 제어하는 데 있어 핵심은 때때로 오염 물질을 얼마나 쉽게 감지할 수 있느냐와 관련이 있습니다. 박테리아, 곰팡이, 효모 오염 물질은 육안으로 쉽게 확인할 수 있고 배양 중인 세포를 빠르게 죽일 수 있지만 미묘한 형태 때문에 마이코플라스마와 같은 중요한 미생물 침입자를 식별하기가 더 어려울 수 있습니다. 이에 비해 바이러스는 기존의 광학 현미경으로는 전혀 검출할 수 없기 때문에 설명할 수 없는 분리나 기타 세포 건강 상태 불량 또는 세포 사멸의 징후를 관찰하여 발견하는 경우가 많습니다.
최근 생물학계가 직면하고 있는 가장 중요한 우려 중 하나는 연구 세포주의 오염 또는 심지어 명백한 오식별입니다. 이 중요한 주제에 대해 자세히 알아보려면 을 클릭하여 교차 오염된 세포주의 원인 및 유병률과 세포주 식별의 무결성을 평가하는 방법을 알아보세요.
박테리아, 곰팡이(곰팡이 포함) 및 효모 오염은 일반적으로 배양 배지의 급격한 탁도 및 색상 변화로 육안으로 확인할 수 있습니다(배지에는 가장 일반적인 무독성 pH 지표인 페놀 레드가 보충되어 있습니다.) 표준 광학 현미경으로도 박테리아 세포와 곰팡이 구조를 확인할 수 있으므로 매일 배양액을 현미경으로 관찰하면 미생물 오염을 조기에 발견하고 첫 징후가 나타나면 즉시 적절한 조치를 취할 수 있습니다. 특히 배양 배양기, 배양조 및 생물안전 캐비닛을 포함한 멸균 조직 배양 환경뿐만 아니라 주변 배양물을 보호하기 위해 오염된 배양물을 신속하게 제거해야 합니다. 또한, 구체적인 박테리아 및 곰팡이 검사는 일상적이고 정기적인 품질 관리 검사 절차.
미생물 오염의 일반적인 원인 및 예방
마이코플라즈마는 세포벽이 없는 박테리아 속이기 때문에 세포벽 형성을 억제하여 박테리아의 성장을 제한하는 항생제의 영향을 받지 않습니다. 0.15~0.3 µm 범위의 유연한 형태와 세포 크기로 인해 0.22 µm 기공의 필터를 사용하는 표준 세포 배양 여과 방식에서 벗어날 수 있습니다. 대부분의 다른 박테리아 오염물질과 달리 마이코플라즈마는 일반적인 검사로는 눈에 띄지 않으며, 형태와 크기가 매우 작기 때문에 광학 현미경으로 검출하기 어렵습니다. 배양에서 마이코플라스마 역가는 배지의 탁도를 유발하지 않고도 108 유기체/mL에 도달할 수 있습니다. 일반적으로 감염된 포유류 세포를 죽이지는 않지만 세포 대사를 변화시키고 염색체 이상을 유발하며 세포 성장을 늦추고 세포 부착을 방해하여 배양에 상당한 영향을 미칩니다. 요컨대, 감염된 세포주를 사용하여 수행하는 대부분의 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
그림 2.형광 현미경을 사용하여 오염된 배양액(오른쪽)에 마이코플라즈마가 있는지 확인하려면 DAPI 또는 Hoechst와 같은 일반적인 DNA 검출 시약을 사용하세요.
실험실 내 마이코플라스마 오염원은 다양하기 때문에 문제가 될 수 있습니다. 특정 마이코플라스마 종은 사람의 피부에서 발견되기 때문에 부실한 무균 기술을 통해 유입될 수 있으며, 태아 소 혈청과 같은 오염된 보조제를 통해 유입될 수도 있습니다.
마이코플라스마는 주변 오염된 세포 배양 사이에서 전염력이 높습니다. 0.22 또는 0.45 µm의 기공을 가진 표준 배지 여과 장치로는 이러한 작은 유기체를 배제하지 못하므로 마이코플라스마 처리에는 0.1 µm 이하의 기공을 가진 멤브레인이 있는 여과 배지와 완충액이 필요합니다.마이코플라스마 오염 예방, 감지 및 제거
마이코플라스마가 배양을 오염시키면 실험실의 다른 영역으로 빠르게 확산될 수 있습니다. 좋은 실험실 관행이 핵심이며, 마이코플라스마 오염을 성공적으로 제어하기 위해서는 마이코플라스마에 대한 정기적인 검사를 적극 권장합니다. 가장 많이 사용되는 세 가지 검출 방법은 다음과 같습니다. 마이코플라스마 배양, DNA 염색 방법 및 PCR 기반 검출.엔드레스하우저는
미생물 오염 방지: 항생제가 정답인가요? 조직 배양에서 항생제를 단독으로 또는 항진균제와 함께 칵테일로 사용하는 것이 일상화되어 있습니다. 의사가 처방하는 치료용 항생제와 마찬가지로 항생제를 지속적으로 또는 부적절하게 사용하면 박멸하기 어려운 내성 균주가 발생할 수 있으며 세포 배양에 독성이 있을 수 있는 차세대 항생제를 사용해야 할 수도 있습니다. 최근 연구에서는 항생제 사용 시 배양 세포의 유전자 발현이 변질될 가능성에 대한 우려가 추가로 제기되었습니다. |
바이러스 오염
바이러스는 배양에서 검출하기 가장 어려운 세포 배양 오염 물질 중 하나로, 대부분의 연구실에서는 비현실적인 현미경 검사 방법을 필요로 합니다. 바이러스는 환자 또는 숙주 동물 세포에서 유래할 수 있으며, 생명공학적으로 중요한 몇몇 세포주에는 내인성 레트로바이러스가 포함되어 있는 것으로 밝혀졌습니다. 세포는 배양에 사용되는 동물 유래 물질에 존재하는 바이러스에 의해 감염되는 경우가 더 흔합니다. 바이러스는 크기가 작기 때문에 배지, 혈청 및 기타 생물학적 기원의 용액에서 제거하기가 매우 어렵습니다. 그러나 대부분의 바이러스는 숙주, 심지어 조직에 제한을 받기 때문에 종간 또는 조직 간 감염 능력이 제한될 수 있습니다. 바이러스는 많은 연구자들이 생각하는 것보다 세포 배양에서 더 흔할 수 있지만, 세포에 세포증식이나 기타 부작용을 유발하지 않는다면 세포 배양에 중대한 교란 요인이 될 수도 있고 아닐 수도 있습니다.
배양 세포에 영향을 미칠 가능성 외에도 바이러스에 감염된 세포 배양 사용의 주요 우려는 실험실 직원에게 잠재적인 건강 위험을 초래할 수 있다는 점입니다. 인간 또는 다른 영장류의 조직이나 세포로 작업할 때는 항상 특별한 안전 예방 조치를 취하여 세포 배양에서 실험실 직원에게 바이러스 감염(HIV, B형 간염, 엡스타인-바, 시미안 헤르페스 B 바이러스 등)이 전염되지 않도록 해야 합니다. 잠재적으로 위험한 조직, 배양 또는 바이러스 작업 절차에 대해서는 기관 환경 안전 책임자와 상의해야 합니다. 세포 배양 작업을 하는 실험실 직원을 위한 위험 평가에 대한 자세한 내용은 클릭 여기를 클릭
세포 배양의 바이러스 오염 발생을 줄이기 위한 모범 사례:
*세포를 추출하는 생물학적 공급원(공급업체, 동물)의 수를 제한합니다.
*바이러스에 덜 취약한 동물/세포를 선택합니다.
*바이러스 검사를 수행하고 바이러스가 없는 세포주 인증을 제공하는 저장소에서 세포를 공급받습니다.
화학적 오염
세포 배양의 비생물 오염물질은 종종 '화학적' 오염물질로 분류됩니다.이러한 오염물질은 배지나 완충액에 사용되는 시약이나 물, 장비 및 소모품에서 발생할 수 있으며, 예를 들면 자유 라디칼, 금속 이온, 소독제/세제 잔류물 또는 상류 박테리아 오염물질이 더 이상 존재하지 않는 후에도 지속되는 내독소 등이 있습니다.
화학물질 오염을 예방하기 위한 팁:
*완충액과 용액을 준비하고 동결 건조된 시약을 재현탁할 때는 항상 실험실 등급의 용수를 사용합니다.
*재사용 가능한 모든 실험기구는 완전히 헹구어야 하며, 공기 건조 고압 멸균은 세제 잔류에 영향을 미치지 않습니다.
*배지, 보충제 및 혈청(FBS, FCS)은 엔도톡신 테스트 인증을 제공하는 공급업체로부터만 구입해야 합니다.
오염 예방 및 제거를 위한 일반적인 팁과 기법
생물학적 안전 캐비닛 내에서 작업하기
생물안전 캐비닛 내에서 작업할 때는 멸균 환경을 유지하는 데 공기 흐름이 중요하다는 점을 기억하는 것이 도움이 됩니다. 효과적인 공기 흐름을 위해 후면과 전면 통풍구 모두 항상 깨끗하게 유지해야 합니다. 작업자의 소매와 손에 오염 물질이 묻을 가능성을 최소화하기 위해 실제 절차 전에 캐비닛에 필요한 모든 재료를 구비해야 합니다.
공기 흐름이 시작된 후 최소 20분이 경과한 후에 캐비닛에 사용할 물품을 넣어야 합니다. 캐비닛에 들어가는 모든 물품은 먼저 70%(v/v) 멸균 알코올을 뿌린 후 보풀이 없는 물티슈로 닦아 먼지와 미립자가 캐비닛으로 유입되는 것을 방지해야 합니다<. 상판이나 용기를 열기 전에 공기 흐름이 원활하게 이루어지도록 하여 유입되었을 수 있는 미립자를 작업 공간에서 제거할 수 있도록 합니다.
그림 3.안전 캐비닛에서 작업하기
에어로졸의 피펫팅 및 예방
일회용 플라스틱 피펫(
1~100mL 용량으로 제공되는 일회용 플라스틱 피펫(혈청학적 피펫이라고도 함)은 세포 배양에 없어서는 안 될 필수 도구입니다. 멸균을 위해 반드시 개별 포장해야 합니다. 다음 지침을 준수하면 피펫팅과 관련된 오염 및 안전 위험을 최소화할 수 있습니다.
- 자동 피펫 보조기구를 사용하고 각 피펫 보조기구는 단일 캐비닛에서 사용하도록 제한합니다. 오염을 방지하려면 피펫 보조기구 부품을 정기적으로 분해하고 소독합니다. 파이펫 보조 필터를 잘 보관하고 정기적으로 교체하십시오.
- 특히 매질을 옮길 때는 가능하면 항상 플러그가 있는 파이펫(상단을 면으로 막음)을 사용하십시오. 파이펫 플러그에 액체가 들어가지 않도록 하십시오. 실수로 플러그가 젖었을 경우 즉시 피펫 보조 필터를 교체하십시오.
- 혈청 피펫의 포장을 부분적으로 풀고 끝을 피펫 보조에 끼운 다음 종이 슬리브를 제거하여 피펫을 완전히 만지지 마십시오.
- 오염 에어로졸을 생성하지 않으려면 매질이나 피펫에 기포를 만들지 마십시오.
소독
배양 폐기물, 작업 표면 및 장비의 소독/오염 제거를 위해 고안된 방법은 오염 위험을 최소화할 뿐만 아니라 실험실 직원에게 안전해야 합니다. 농축된 형태의 소독제를 사용할 때는 항상 장갑과 보안경 등 적절한 개인보호장비(PPE)를 착용하세요. 선택한 장갑은 취급하는 물질로부터 보호해야 합니다. 제조업체의 차트는 특정 작업에 가장 적합한 장갑을 식별하는 데 도움이 됩니다. 주요 소독제는 몇 가지 그룹으로 분류되며, 상대적인 장점은 다음과 같이 요약할 수 있습니다:
차아염소산나트륨 또는 표백제
- 좋은 범용 소독제
- 바이러스에 효과적
- 금속에 부식성-원심분리기 등 금속 표면에는 사용하지 않아야 함
- 유기물에 의해 쉽게 불활성화되므로 자주 새로 만들어야 함
- 시판 표백제를 사용하여 폐액 또는 표면 소독을 위해 10% (v/v) 용액을 만드십시오
알코올 (e.예: 에탄올, 이소프로판올)
- 유효 농도: 에탄올의 경우 70%, 이소프로판올의 경우 60-70%
- 박테리아에 효과적입니다. 에탄올은 대부분의 바이러스에 효과적이지만 외피가 없는 바이러스에는 효과적이지 않습니다
- 이소프로판올은 바이러스에 효과가 없습니다
- 알데히드는 자극성이 있으므로 사용을 제한해야 합니다
페놀 기반 소독제는 EU 살생물 제품 지침 검토 프로그램의 일부로 지원되지 않으므로 피해야 합니다.
건강한 세포의 일상적인 모니터링 수행 방법
세포 배양 모니터링은 일상적인 세포 배양에서 중요한 부분입니다. 이 튜토리얼에서는 건강한 배양의 모습, 세포 합류, 세포 배양 성장의 여러 단계 등 세포 모니터링의 기본 사항을 설명합니다. 또한 박테리아 및 마이코플라스마 오염의 일반적인 지표에 대해서도 설명합니다.