항생제 살균 곡선
항생제 살균 곡선이란 무엇인가?
항생제 살균 곡선은 포유류 세포를 점차 증가하는 양의 선택 항생제에 노출시켜 특정 시간 내에 모든 세포를 사멸시킬 수 있는 항생제의 최소 농도를 결정하는 용량 반응 실험입니다. 이는 선택 항생제를 사용하여 비전사 세포를 사멸시키고 안정적인 세포주를 생성하기 전에 수행해야 하는 중요한 단계입니다. 각 포유류 세포주는 항생제 감수성이 다르기 때문에, 서로 다른 세포주와 항생제에 대해 별도의 살균 곡선 실험을 수행하는 것이 항상 권장됩니다.
살균 곡선 실험을 위한 권장 항생제 농도
아래 표는 용량 반응 실험에 채택될 수 있는 일반적으로 사용되는 선택 항생제의 농도 범위를 나타냅니다.
용량 반응은 시험 대상 세포주에 따라 달라질 수 있습니다. 제시된 농도 범위는 참고용일 뿐이며, 선택 항생제를 처음 사용하거나 새로운 세포주에 적용할 때는 반드시 킬 커브 실험을 수행해야 합니다.
킬 커브 프로토콜
다음 프로토콜은 세포에 대한 킬 커브를 생성하는 단계를 설명합니다.
필요한 사항:
- 건강한 상태의 대상 세포주
- 해당 세포주에 권장되는 완전 배지(배지 + 혈청)
- 관심 있는 선택 항생제
단계:
- 트립신 사용 또는 부드러운 세포 스크래핑을 통해 건강한 부착 세포를 수확합니다.
- 완전 배지에서 세포 현탁액을 희석하고, 최종 부피가 100μl가 되도록 96-웰 플레이트의 각 웰에 접종하십시오. 권장 세포 밀도는 처리 당일 기준 약 50%입니다.
- 항생제 처리 전 24-웰 플레이트의 일반적인 세포 밀도:
- 부착 세포: 0.8 – 2.5 X10⁵ 세포/ml
- 2.5 – 4.5 X10⁵ 세포/ml 현탁 세포
- 37 °C에서 하룻밤 또는 모든 세포가 잘 적응하고 건강한 상태가 될 때까지 배양합니다.
참고: 항생제는 세포가 활발히 분열할 때 가장 효과적이므로, 가장 정확한 용량 반응을 위해 최적의 세포 농도를 권장합니다.
그림 1.개략적 가이드 – 항생제 농도 선택.
- 배지를 선택적 항생제의 농도가 다른 신선한 배지로 교체하십시오. 96-웰 플레이트 형식(그림 1)에 표시된 대로 각 농도를 3회 반복하여 유지하십시오.
- 배지를 항생제가 포함된 배지로 48시간마다 교체하십시오.
- 세포를 7~10일간 배양하며 광학 현미경으로 정기적으로 관찰하십시오. 사용된 세포주에 따라 배양 기간은 14일까지 연장될 수 있습니다.
- 10일차에 MTT 분석법 또는 정밀 세포 계수기를 사용하여 각 웰의 세포 생존율을 측정하십시오.
- 세포 성장을 완전히 차단하는 항생제 농도를 선택하십시오. 이 농도를 모든 형질 도입 실험에 사용해 내성 형질 도입 세포를 선별하고, 이를 안정적인 세포주로 추가 배양하십시오(그림 2).
그림 2.모의 항생제 살균 곡선
유의사항
- 적절한 대조군 또는 블랭크 유지:
- 항생제만 함유된 배지가 있는 웰, 세포 없음
- 배지와 세포만 포함된 웰, 항생제 없음
- 배지 증발로 인한 항생제 농도 상승 및 오독을 방지하기 위해 인큐베이터가 완벽한 작동 상태인지 확인하십시오
세포에 적합한 항생제를선택하십시오.
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재료
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