HPLC de moléculas grandes

HPLC
de biomoléculas en fase inversa

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) es una técnica sensible y versátil que se utiliza para separar y analizar proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos. La RP-HPLC utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La retención de proteínas y péptidos en la fase estacionaria se rige por los principios de adsorción y partición. Las regiones hidrofóbicas de las proteínas se adhiren de forma reversible a la fase estacionaria. Las proteínas se eluyen aumentando el carácter no polar de la fase móvil. La resolución puede verse afectada por el tamaño de los poros, el tamaño de las partículas, la longitud de la columna y la cadena de hidrocarburos unida a la fase estacionaria.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un modo de cromatografía no desnaturalizante que separa las moléculas en función de su tamaño (es decir, su radio hidrodinámico). Este modo no se basa en la interacción del analito con la fase estacionaria, sino en el flujo aleatorio del analito a través de las partículas de la fase estacionaria. Los analitos de alto peso molecular se eluyen antes, ya que quedan total o parcialmente excluidos de los poros de las partículas de la fase estacionaria, mientras que los analitos de menor peso molecular se eluyen más tarde, ya que tardan más tiempo en recorrer el tortuoso camino a través de la partícula. La SEC se ha utilizado para caracterizar agregados y fragmentos de anticuerpos monoclonales (mAb), estimar los pesos moleculares de proteínas desconocidas y determinar la estabilidad de las formulaciones proteicas.

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es un modo de cromatografía que separa los analitos en función del grado de interacción entre los grupos hidrofóbicos del analito y los ligandos hidrofóbicos de la fase estacionaria. Debido a su menor peso molecular y a su menor propensión al plegamiento, la HIC no suele utilizarse en la separación de péptidos. En concentraciones elevadas de sal, las capas de hidratación de las proteínas pueden verse alteradas lo suficiente como para que las regiones superficiales hidrofóbicas entren en contacto con la fase estacionaria no polar. La selección de sales viene dictada por la serie de Hofmeister, que clasifica a los cationes y aniones según su capacidad para alterar las capas de hidratación de las proteínas (caotrópicos) o para favorecer la formación de dichas capas (cosmotrópicos). Entre las sales típicas se incluyen el sulfato de amonio, el sulfato de potasio y el sulfato de sodio. La cromatografía de interacción hidrofóbica se utiliza actualmente para determinar el perfil de la relación fármaco-anticuerpo (DAR) de los conjugados de anticuerpos y fármacos (ADC).

Cromatografía de intercambio iónico (IEX)

La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es un método cromatográfico que separa los analitos en función de su carga. Las proteínas y los péptidos son anfóteros, lo que significa que presentan funcionalidades tanto ácidas como básicas. Las funcionalidades ácidas de las proteínas incluyen el ácido aspártico, el ácido glutámico, la cisteína, la tirosina y el grupo α-carboxilato del extremo C-terminal. Las funcionalidades básicas de las proteínas incluyen la arginina, la histidina, la lisina y el α-aminogrupo del extremo N-terminal. Las variantes de carga de los productos bioterapéuticos pueden detectarse y resolverse mediante IEX. Las variantes de carga pueden deberse a errores de traducción en la transcripción del ARN mensajero (ARNm) y/o a modificaciones postraduccionales, como la desamidación, la oxidación o la glicosilación.

La columna de IEX debe seleccionarse en función del punto isoeléctrico (pI) del analito. Si el pH de la fase móvil es inferior al pI, el analito tendrá carga positiva y se unirá a una columna de intercambio catiónico. Si el pH de la fase móvil es superior al pI, el analito tendrá carga negativa y se unirá a una columna de intercambio aniónico.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en una interacción específica entre un analito y un ligando de la fase estacionaria. En condiciones ideales, solo el analito de interés se une a la fase estacionaria, lo que permite que el resto de componentes de la muestra atraviesen la columna. A continuación, se hace pasar una segunda fase móvil a través de la columna para eluir el analito.

La cromatografía de proteína A es la forma más común de cromatografía de afinidad empleada en la industria biofarmacéutica. La proteína A es una proteína de superficie de 42 kDa que se encuentra en la pared celular de S. aureus. Esta proteína se une específicamente a la cadena pesada en la región Fc de las IgG, lo que la convierte en un mecanismo ideal para separar las IgG de otros componentes de la muestra.  La mayoría de las columnas de proteína A se fabrican inmovilizando la proteína sobre una partícula orgánica porosa. Sin embargo, se ha desarrollado un formato monolítico para la cromatografía de proteína A, lo que permite un alto rendimiento de muestras a diversos caudales, sin sacrificar la eficiencia.