HPLC de moléculas grandes

HPLC de biomoléculas en fase inversa

La HPLC de fase inversa (RP-HPLC) es una técnica sensible y versátil que se utiliza para separar y analizar proteínas, fragmentos de proteínas y péptidos. La RP-HPLC utiliza una fase estacionaria no polar y una fase móvil polar. La retención de proteínas y péptidos en la fase estacionaria sigue los principios de adsorción y partición. Las regiones hidrofóbicas de las proteínas se adhieren de forma reversible a la fase estacionaria. Las proteínas se eluyen aumentando la naturaleza no polar de la fase móvil. La resolución puede verse afectada por el tamaño de los poros, el tamaño de las partículas, la longitud de la columna y la cadena de hidrocarburos unida a la fase estacionaria.

Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es un modo de cromatografía no desnaturalizante que separa las moléculas por su tamaño (es decir, su radio hidrodinámico). Este modo no se basa en la interacción del analito con la fase estacionaria, sino en el flujo aleatorio del analito a través de las partículas de la fase estacionaria. Los analitos de alto peso molecular se eluyen antes, ya que se excluyen total o parcialmente de los poros de las partículas de la fase estacionaria, mientras que los analitos de menor peso molecular se eluyen más tarde, ya que pasan más tiempo recorriendo el tortuoso camino a través de la partícula. La SEC se ha utilizado para caracterizar los agregados y fragmentos de anticuerpos monoclonales (mAbs), estimar los pesos moleculares de proteínas desconocidas y determinar la estabilidad de la formulación de proteínas.

Cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC)

La cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) es un modo de cromatografía que separa los analitos en función del grado de interacción entre los fragmentos hidrofóbicos del analito y los ligandos hidrofóbicos de la fase estacionaria. Debido a su menor peso molecular y menor propensión al plegamiento, la HIC no se suele utilizar en la separación de péptidos. En concentraciones elevadas de sal, las capas de hidratación de las proteínas pueden verse lo suficientemente alteradas como para que las regiones superficiales hidrofóbicas interactúen con la fase estacionaria no polar. La selección de la sal viene dictada por la serie de Hofmeister, que clasifica los cationes y los aniones según su capacidad para alterar las capas de hidratación de las proteínas (caotrópicos) o promover la formación de capas de hidratación de las proteínas (cosmótropos). Las sales típicas incluyen el sulfato de amonio, el sulfato de potasio y el sulfato de sodio. La cromatografía de interacción hidrofóbica se utiliza actualmente para determinar el perfil de la relación fármaco-anticuerpo (DAR) de los conjugados fármaco-anticuerpo (ADC).

Cromatografía de intercambio iónico (IEX)

La cromatografía de intercambio iónico (IEX) es un modo de cromatografía que separa los analitos por carga. Las proteínas y los péptidos son anfóteros, lo que significa que presentan funcionalidades tanto ácidas como básicas. Las funcionalidades ácidas de las proteínas incluyen el ácido aspártico, el ácido glutámico, la cisteína, la tirosina y el α-carboxilato del extremo C-terminal. Las funcionalidades proteicas básicas incluyen la arginina, la histidina, la lisina y el α-amina N-terminal. Las variantes de carga bioterapéuticas pueden detectarse y resolverse mediante IEX. Las variantes de carga pueden surgir de la traducción errónea de la transcripción del ARN mensajero (ARNm) y/o de modificaciones postraduccionales, como la desamidación, la oxidación o la glicosilación.

La columna IEX debe seleccionarse en función del punto isoeléctrico (pI) del analito. Si el pH de la fase móvil es inferior al pI, el analito tendrá carga positiva y se unirá a una columna de intercambio catiónico. Si el pH de la fase móvil es superior al pI, el analito tendrá carga negativa y se unirá a una columna de intercambio aniónico.

Cromatografía de afinidad

La cromatografía de afinidad se basa en una interacción específica entre un analito y un ligando de fase estacionaria. Lo ideal es que solo el analito de interés interactúe con la fase estacionaria, permitiendo que todos los demás componentes de la muestra pasen a través de la columna. A continuación, se hace pasar una segunda fase móvil a través de la columna para eluir el analito.

La cromatografía de proteína A es la forma más común de cromatografía de afinidad empleada en la industria biofarmacéutica. La proteína A es una proteína de superficie de 42 kDa que se encuentra en la pared celular del S. aureus. Esta proteína se une específicamente a la cadena pesada en la región Fc de las IgG, lo que la convierte en un mecanismo ideal para separar las IgG de otros componentes de la muestra.  La mayoría de las columnas de proteína A se fabrican inmovilizando la proteína en una partícula orgánica porosa. Sin embargo, se ha producido un formato monolítico para la cromatografía de proteína A, lo que permite un alto rendimiento de muestras a diversos caudales, sin sacrificar la eficiencia.