Colagenasa from Clostridium histolyticum

La colagenasa de Clostridium histolyticum se utiliza mucho en los estudios biológicos, donde se utiliza para preparar suspensiones de células aisladas. Este producto es adecuado para la desagregación de los tumores humanos, el riñón de ratón, cerebro fetal y adulto humano, el pulmón y muchos otros tejidos epiteliales. También se ha demostrado su eficacia en los estudios de perfusión del hígado y el riñón, de digestión del páncreas, de aislamiento de las células hepáticas no parenquimatosas de rata y en la preparación de hepatocitos. La colagenasa se ha utilizado también para la preparación de tejido arterial para el estudio de los productos finales de glucosilación avanzada. Se ha estudiado esta enzima para la liberación de hepatocitos a una concentración aproximada de 1 mg/ml. Concentraciones para el intervalo de digestión entre 0,1 y 5,0 mg/ml.

La colagenasa es activada por cuatro átomo-gramos de calcio por mol de enzima. Es inhibida por el ácido etilenglicol-bis(beta-aminoetil éter) - N, N, N′,N′-tetraacético, el beta-mercaptoetanol, el glutatión, el ácido tioglicólico y la 8-hidroxiquinolina.

La colagenasa es una mezcla de enzimas secretadas por C. histolyticum y los diferentes productos se diferencian por las proporciones relativas de los 10-18 componentes que se encuentran en las enzimas secretadas. Los principales componentes son dos colagenasas, la clostripaína y una proteasa neutra. La acción sinérgica de esas enzimas degrada el colágeno y otro material intracelular. La acción de las dos colagenasas y la proteasa neutra es necesaria para la separación efectiva de las células del tejido. Los sustratos naturales para la colagenasa son varios tipos de colágeno.

Tal como se entrega, este producto es estable durante un año a 2-8°C. No hay pérdida de actividad FALGPA ni proteasa en 30 días a 37°C, 50°C y -20°C. Las disoluciones de colagenasa cruda son estables si se congelan rápidamente en alícuotas (a 10 mg/ml) y se mantienen congeladas a -20°C. Otros ciclos de congelación y descongelación dañarán la disolución. El producto retiene el 100 % de su actividad durante 7 horas si se conserva en hielo.

La colagenasa es una proteasa que rompe la triple hélice proteica denominada colágeno. Hay tres tipos de colagenasas en los tejidos, que pertenecen a la familia de las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMP). La colagenasa obtenida de Clostridium histolyticum tiene una actividad muy fuerte, ya que digiere el colágeno desde ambos extremos a temperaturas de tan sólo 4-10°C. Las mezclas de colagenasa cruda contienen dos tipos principales de enzima , colagenasa y clostripaína.

Una unidad de digestión de colágeno (CDU) libera péptidos del colágeno del tendón de Aquiles bovino que equivalen en la reacción de color de la ninhidrina a 1,0 μmoles de leucina en 5 horas a pH 7,4 y 37 °C en presencia de iones calcio. Una unidad de hidrólisis FALGPA hidroliza 1,0 μmoles de furilacriloil-Leu-Gly-Pro-Ala por minuto a 25°C. Una unidad de proteasa neutra hidroliza la caseína para producir color equivalente a 1,0 μmoles de tirosina por 5 horas a pH 7,5 y 37°C. Una unidad de clostripaína hidroliza 1,0 μmoles de BAEE por minuto a pH 7,6 y 25°C en presencia de DTT.

Este producto es un equivalente a la primera fracción de sulfato de amonio al 40% de Mandl, I., et al., J. Clin. Invest., 32, 1323 (1953). Las disoluciones se preparan normalmente a 1-2 mg/ml en tampón TESCA (que contiene TES 50 mM, cloruro de calcio 0,36 mM a pH 7,4 y 37°C.)