Reactivos y sustratos de inmunodetección
En el Western blot, el factor más importante para determinar el éxito de los experimentos es la calidad de los reactivos utilizados. Ofrecemos una amplia gama de reactivos para Western blot que han sido preoptimizados para actuar de forma sinérgica, lo que proporciona señales específicas intensas y un fondo bajo para ayudarte a obtener rápidamente resultados con calidad de publicación.
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Reactivos de bloqueo
El bloqueo de los sitios no ocupados de la membrana evita la unión inespecífica de anticuerpos, lo que puede provocar un fondo elevado. Los bloqueadores tradicionales a base de leche, gelatina y otras proteínas son eficaces para muchas aplicaciones de transferencia, pero pueden reducir la sensibilidad o la detección al enmascarar la señal o interferir en la detección de proteínas diana específicas. Los reactivos de cancelación de ruido Immobilon® Block incluyen tampones sin proteínas y listos para usar, optimizados para reducir los niveles de fondo cuando se utiliza la detección por quimioluminiscencia, fluorescencia o fosfoproteínas.
Conjugados de estreptavidina y anticuerpos secundarios
Los métodos modernos de inmunodetección se basan en la detección enzimática mediante estreptavidina o anticuerpos secundarios unidos covalentemente a enzimas como la peroxidasa de rábano picante (HRP) o la fosfatasa alcalina (AP). La enzima conjugada cataliza la degradación de sustratos específicos, lo que da lugar a la generación de una señal. Existe una amplia variedad de conjugados de estreptavidina, proteína A, proteína G y anticuerpos secundarios disponibles para el Western blot. También ofrecemos una amplia selección de sustratos de HRP y AP para la detección quimioluminiscente, cromogénica y quimiofluorescente en el Western blot.
Sustratos quimioluminiscentes para western blot
Los sustratos Immobilon® HRP para la detección quimioluminiscente proporcionan una mayor sensibilidad para obtener transferencias más cuantitativas, lo que reduce los costes al permitir disminuir la concentración de anticuerpo utilizada para la detección. Elija entre una gama de sustratos Immobilon® con diferentes sensibilidades, disponibles en prácticos formatos listos para usar o de dos componentes, para optimizar la detección en su aplicación de Western blot.
- Los sustratos quimioluminiscentes Immobilon® Classico, Crescendo y Forte conforman una familia de reactivos premezclados y listos para usar para la detección basada en peroxidasa, disponibles en una gama de sensibilidades para proporcionar relaciones señal-ruido óptimas en un amplio espectro de concentraciones de proteína diana. Límites de detección:
- Immobilon® Classico: ~ 6 pg de proteína diana
- Immobilon® Crescendo: ~ 1-3 pg de proteína diana
- Immobilon® Forte: ~ 400 fg de proteína
diana
- Los sustratos Immobilon® Western HRP, Immobilon® ECL Ultra e Immobilon® UltraPlus Western ofrecen una sensibilidad excepcional y una larga duración de la señal en formatos estándar de dos componentes. Estas formulaciones permiten el uso de soluciones de anticuerpos primarios más diluidas para la detección por inmunotransferencia. Límites de detección:
- Sustrato Immobilon® Western HRP: ~ 400 fg de proteína diana
- Sustrato Immobilon® ECL Ultra: rango de femtogramos bajos
- Sustrato Immobilon® ECL UltraPlus Western Blot HRP: rango de femtogramos bajos
Sensibilidad relativa de los sustratos quimioluminiscentes HRP de Immobilon®
Figura 1.Se analizó una serie de diluciones dobles del lisado celular de A431 [12-110], partiendo de 4 μg de proteína, en geles mPAGE® al 10 % [MP10W15] en tampón MOPS [MPM0PS] a 200 V durante 25 minutos. La proteína se transfirió a una membrana Immobilon®-P [IPVH00010] durante 1 hora en tampón de transferencia mPAGE® [MPTRB] con un 10 % de etanol. La inmunodetección de la proteína HH3 (15 kDa) se realizó con anticuerpos de conejo anti-HH3 [H0164] y de cabra anti-conejo [AP132P] en las diluciones indicadas. Los blots se incubaron con los reactivos ECL indicados durante 5 minutos y se obtuvieron imágenes con una exposición de 30 s en el sistema Bio-Rad® ChemiDoc.
Los reactivos de detección Cytiva™ Amersham™ ECL utilizan un método de detección mejorado basado en luminol y HRP, y están disponibles en diferentes formulaciones para cubrir las distintas necesidades de las aplicaciones de Western blot.
- Los reactivos de detección para Western blot Cytiva Amersham™ ECL se recomiendan para aplicaciones de Western blot de confirmación.
- El reactivo de detección para Western blot Cytiva Amersham™ ECL Prime permite detectar tanto proteínas de alta como de baja abundancia en la misma transferencia.
- Los reactivos de detección para Western blot Cytiva Amersham™ ECL Select ofrecen una alta sensibilidad incluso cuando se utilizan anticuerpos primarios y secundarios diluidos.
- El reactivo de detección para Western blotting Cytiva Amersham™ ECL Start se ha desarrollado para la detección quimioluminiscente de proteínas de expresión media y alta.
Sustratos cromogénicos para el western blot
La detección cromogénica utiliza una enzima conjugada con peroxidasa (por ejemplo, HRP) o fosfatasa alcalina (AP) para catalizar una reacción que da lugar a la formación de un precipitado coloreado insoluble que permite la detección. Nuestros sustratos cromogénicos para Western blotting están disponibles en forma de solución, polvo y comprimidos, lo que ofrece opciones flexibles de almacenamiento y uso.
- Los comprimidos SIGMAFAST™ DAB (sustrato cromogénico de HRP) están compuestos por un sustrato precipitante colorimétrico que produce un color marrón al reaccionar con la peroxidasa de rábano picante y que puede disolverse en agua para preparar una solución tamponada lista para usar en la detección mediante Western blotting.
- BCIP/NBT (azul/púrpura) y BCIP/TNBT (azul/marrón) de un solo reactivo (sustratos cromogénicos de AP) son sustratos colorimétricos de alta sensibilidad para la fosfatasa alcalina.
- El sustrato de membrana TMB mejorado de un solo componente para HRP (sustrato cromogénico para HRP) es un sustrato colorimétrico de un solo componente que produce un producto de color azul oscuro.
Potenciadores de señal
- El potenciador de señal Immobilon® está diseñado para su uso en aplicaciones de Western blot cuando se observa una baja intensidad de señal. La potenciación de la reacción anticuerpo-antígeno puede producir un aumento de entre 2 y 10 veces en la intensidad de la señal. El potenciador de señal Immobilon® es compatible con membranas de PVDF y nitrocelulosa, y puede utilizarse con métodos de detección cromogénicos, quimioluminiscentes y fluorescentes.
- El kit potenciador de inmunorreacción SignalBoost™ está diseñado para potenciar la señal de la diana quimioluminiscente o colorimétrica en membranas de nitrocelulosa o PVDF.
Reactivos y kits para la eliminación y la nueva detección
Los reactivos de eliminación y nueva detección están especialmente formulados para eliminar de forma rápida y eficaz los anticuerpos de los Western blots sin afectar significativamente a las proteínas inmovilizadas.
- Los reactivos ReBlot™ Plus eliminan de forma eficaz los anticuerpos unidos de los blots ya hibridados. Los reactivos ReBlot™ Plus están disponibles en formulaciones suaves y fuertes.
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