ChIPAb+ triméthyl-histone H3 (Lys4) – Ensemble d′anticorps et d′amorces validé par ChIP, IgG monoclonale de lapin

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Immunoprécipitation de la chromatine :
La chromatine soniquée préparée à partir de cellules HeLa non traitées (1 × 10⁶ équivalents cellulaires) a été soumise à immunoprécipitation en utilisant 3 μl d'IgG de lapin normale ou 3 μl d'IgG monoclonale anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) et le kit Magna ChIP A (réf. 17-610). La réussite de l'immunoprécipitation des fragments d'ADN associés à la triméthyl-histone H3 (Lys4) a été vérifiée par qPCR à l'aide d'amorces ChIP témoins encadrant le promoteur du gène GAPDH humain (voir figures). Voir le protocole EZ-Magna A ChIP pour obtenir les détails des expériences.

Témoin
Comprenait un anticorps témoin négatif (IgG de lapin purifiée) et des amorces témoins spécifiques du promoteur du gène GAPDH humain.

Immunoprécipitation de la chromatine :
Chromatine soniquée préparée à partir de chromatine non traitée ou traitée aux UV (6 h, 50 joules/m2.) Des cellules U2OS (3 × 10⁶ équivalents cellulaires par IP) ont été soumises à l'immunoprécipitation de la chromatine en utilisant 3 μl d'anti-triméthyl histone H3 (Lys4) de lapin et le kit Magna ChIP A (réf. 17-610). L'immunoprécipitation des fragments d'ADN associés au triméthyl-histone H3 (Lys4) a été vérifiée par qPCR à l'aide d'amorces ChIP p21 encadrant le promoteur du gène p21 humain qui contient un site de liaison Sp1 (voir figures).
Le facteur d'augmentation est un rapport entre les quantités d'IP moyennes normalisées extraites des courbes standards dérivées des entrées de chaque échantillon de chromatine. Comme observé dans d'autres études, l'activité immunoprécipitable de la triméthyl-histone (Lys4) associée à ce promoteur augmente avec le traitement aux UV.
Voir le protocole EZ-Magna A ChIP (réf. 17-408) ou EZ-ChIP (réf. 17-371) pour obtenir les détails des expériences.

Analyse par ChIP-seq :
Une immunoprécipitation de la chromatine a été réalisée à l'aide du kit Magna ChIP HiSens (17-10460), 3 µl d'anticorps anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) (réf. 17-614) ou 20 µl de billes avec protéine A/G et la chromatine de 1e6 cellules HeLa réticulée, suivie d'une purification de l'ADN à l'aide de billes magnétiques. Des banques ont été préparées à partir des échantillons d'ADN "input" et ChIP selon des protocoles standards avec des adaptateurs à code-barres Illumina, puis analysées sur un instrument Illumina HiSeq. Plus de dix-huit millions de lectures ("read") tirées de fichiers FastQ ont été alignées ("mapped") avec Bowtie (http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml) après suppression des étiquettes ("tag") avec TagDust (http://genome.gsc.riken.jp/osc/english/dataresource/). Les pics ont été identifiés à l'aide de l'algorithme MACS (http://luelab.dfci.harvard.edu/MACS/) après visualisation des pics et des lectures sous forme de piste personnalisée ("custom track") dans UCSC Genome Browser (http://genome.ucsc.edu) à partir de fichiers BigWig et BED. Les 25 % de pics les plus élevés identifiés dans les ensembles de données 17-614 et 07-473 montraient 99 % de chevauchement avec les pics identifiés dans la piste ENCODE H3K4me3 BROAD Histone pour les cellules HeLa S3.

Analyse par western blotting et inhibition peptidique :
Blot représentatif. L'extrait en milieu acide de cellules HeLa a été réalisé par électrophorèse, transféré sur nitrocellulose et testé avec l'anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) (1/2000e, piste 1) ou préincubé avec 0,4 μM de peptide d'histone H3 et les modifications suivantes : Piste 2 : monométhyl-lysine 4, piste 3 : diméthyl-lysine 4, piste 4 : triméthyl-lysine 4.
Les protéines ont été visualisées à l'aide d'un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à l'HRP et d'un système de détection par chimiluminescence
(voir figures).

Anticorps anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) validé par ChIP et ensemble d'amorces comprenant l'anticorps de qualité ChIP et les amorces PCR témoins spécifiques utilisées pour l'immunoprécipitation de la chromatine d'H3K4Me3.

Domaine de recherche
Épigénétique et fonction nucléaire

Sous-domaine de recherche
Biologie de la chromatine

Triméthyl-histone H3 (Lys4)

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17 kDa

La méthylation des histones peut se produire sur deux résidus différents : l'arginine et la lysine. Selon le résidu méthylé, la méthylation de l'histone peut être associée à l'activation ou à la répression transcriptionnelle. La lysine 4 de l'histone H3 peut être mono-, di- ou triméthylée par différentes méthyltransférases d'histone (HMT) telles que SET1 ou ASH1. La méthylation de la Lys4 est souvent associée à l'activation transcriptionnelle. La déméthylase LSD1 est capable de déméthyler la Lys4 de l'histone H3.

Tous les anticorps ChIPAb+ sont validés individuellement pour la précipitation de la chromatine, sur tous les lots, sans exception. Chaque jeu d'anticorps ChIPAb+ comprend des amorces témoins (testées sur chaque lot par PCR quantitative) vous permettant de valider biologiquement vos résultats d'immunoprécipitation dans un contexte locus-spécifique. Le protocole de PCR quantitative (qPCR) et les séquences des amorces sont fournis, ce qui permet aux chercheurs de valider leur protocole d'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) lorsqu'ils utilisent notre anticorps dans leur contexte chromatinien. Chaque jeu comprend également un anticorps témoin négatif afin de garantir la spécificité de la réaction de ChIP.
Le kit ChIPAb+ triméthyl-histone H3 (Lys4) comprend l'anticorps anti-triméthyl-histone H3 (Lys4), un anticorps témoin négatif (sérum de lapin normal) et des amorces qPCR qui amplifient une région de 166 paires de bases dans le promoteur du gène GAPDH humain. Les anticorps anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) et les anticorps témoins négatifs se présentent dans une taille adaptable à une réaction de ChIP. Ils peuvent être utilisés pour valider fonctionnellement la précipitation de la chromatine associée à la triméthyl-histone H3 (Lys4).

L'anticorps anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) est fabriqué contre un peptide synthétique conjugué à la BSA contenant la séquence …RT[me3K]QT… dans laquelle me3K correspond à la triméthyl-lysine 4 d'histone H3 humaine

Épitope : Triméthyl Lys4

Anti-triméthyl-histone H3 (Lys4) (IgG de lapin purifiée), 1 flacon

IgG de lapin à témoin ChIP négatif, 1 flacon

Amorces ChIP GAPDH, 1 flacon

25 dosages par kit, ~3μl par immunoprécipitation de la chromatine

Format : purifié

IgG de lapin monoclonale recombinante anti-triméthyl-histone H3 (Lys4). Un flacon contenant 75 μl d'IgG de lapin purifiée sur protéine A dans un tampon de conservation (0,1 M de Tris-glycine à pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 0,05 % de NaN3, avec ajout de glycérol à 40 %).

IgG de lapin normale. Un flacon contenant 75 μl d'IgG de lapin normale.

Amorces témoins. Un flacon contenant 75 μl de 5 μM de chaque amorce spécifique de la GAPDH humaine.
POUR : TAC TAG CGG TTT TAC GGG CG
RÉV. : TCG AAC AGG AGG AGC AGA GAG CGA

Stable à -20 °C pendant 1 an à compter de la date de réception