Anticorps anti-protéine fluorescente verte

La protéine fluorescente verte (GFP pour "Green Fluorescent Protein") de la méduse Aequorea victoria sert d'indicateur fluorescent pour le suivi de l'expression génique dans divers systèmes cellulaires, y compris des organismes vivants et des tissus fixés. À la différence d'autres rapporteurs bioluminescents, la GFP émet une fluorescence en l'absence de substrats, de cofacteurs ou d'autres protéines intrinsèques ou extrinsèques. La GFP purifiée est un monomère de 27 kDa qui est constitué de 238 acides aminés et qui émet une lumière verte (pic d'émission à 509 nm) lorsqu'elle est excitée par une lumière bleue ou ultraviolette.

Le poids moléculaire de la GFP est de 27 kDa (variable selon le poids moléculaire de la protéine de fusion détectée).

Une protéine fluorescente verte (GFP) recombinante contenant une étiquette His6 a été hautement purifiée au moyen d'une chromatographie d'affinité sur colonne de nickel suivie d'une chromatographie sur colonne de filtration sur gel P-100.

Analyse par immunotransfert : L'anticorps AB16901 détecte une bande du bon poids moléculaire (30 kDa) dans les lysats d'E. coli exprimant la GFP, mais pas dans les E. coli n'exprimant pas cette protéine, ni dans les lysats préparés à partir de bactéries E. coli contenant le plasmide d'expression de la GFP mais non induites ; il détecte la GFP dans les lysats de cellules COS ou de neurones primaires ou de fibroblastes transfectés avec des plasmides dirigeant l'expression de la GFP ou d'une protéine de fusion tau-GFP. Il ne détecte aucun signal lorsque 50 μg de protéine d'un lysat de cerveau de rat (témoin négatif) est fractionné sur le gel SDS-PAGE. Les titres varient de 10 000 à 20 000 lorsque l'anticorps est détecté au moyen d'un anticorps secondaire anti-poulet conjugué à la peroxydase de raifort, par chimioluminescence amplifiée ou par un test colorimétrique à la diaminobenzidine.

Immunocytochimie : La GFP peut être détectée dans les cellules transfectées avec un plasmide dirigeant l'expression de la GFP ou d'une protéine de fusion avec la GFP. Les cellules qui n'expriment pas la GFP ne présentent aucune coloration détectable. La fixation des anticorps est déterminée au moyen d'anticorps secondaires anti-poulet conjugués à la peroxydase de raifort et visualisée par coloration à la diaminobenzidine. Les anticorps anti-GFP sont utilisés à une dilution du 1/2500e au 1/5000e. Les cellules sont fixées avec 4 % de formaldéhyde dans du PBS (pH 7,4). Pour l'immunocytochimie, les cultures sont fixées dans 4 % de formaldéhyde dans du PBS (pH 7,4) pendant 20 minutes à température ambiante. Les cellules sont perméabilisées avec 0,2 % de Triton X-100 et 2 % de sérum (correspondant à l'animal dans lequel l'anticorps secondaire est produit) dans du PBS, pendant 20 minutes à température ambiante. Les cultures cellulaires sont ensuite incubées avec des antisérums primaires dans du PBS contenant 2 % de sérum (comme ci-dessus), à 4 °C pendant une nuit. La fixation des anticorps est détectée au moyen d'un système de détection avidine/biotine/peroxydase. Les cultures sont lavées quatre fois (10 minutes à chaque fois) entre les étapes, et le produit de la réaction est développé avec une solution de 0,05 % de diaminobenzidine et 0,02 % de peroxyde d'hydrogène, sur de la glace pendant 8 à 10 minutes. L'anticorps AB16901 a été utilisé pour détecter la GFP dans des neurones primaires et des fibroblastes de poisson-zèbre.

Immunoprécipitation : 5 μg d'anticorps pour un maximum de 500 μl de lysat cellulaire. Il est important d'utiliser un anticorps secondaire de lapin anti-poulet pour la capture, ou des billes recouvertes d'anticorps anti-poulet, car les IgG de poulet ne réagissent ni avec la protéine A ni avec la protéine G.

Il revient à l'utilisateur final de déterminer les dilutions de travail optimales.

Cet anticorps anti-protéine fluorescente verte est validé pour une utilisation en immunocytochimie, en immunoprécipitation et en western blotting pour la détection de la protéine fluorescente verte.

Domaine de recherche
Épitopes marqueurs et autres anticorps

Sous-domaine de recherche
Épitopes marqueurs

L'anticorps AB16901 est dirigé contre la GFP native d'Aequorea victoria hautement purifiée. Il réagit avec la GFP, qu'elle soit native ou recombinante.

Format : purifié

Immunoglobuline de poulet purifiée dans du TBS (pH 7,5) avec 0,02 % d'azoture de sodium.

Précipitation au sulfate d'ammonium

La solution d'anticorps non diluée conservée entre 2 °C et 8 °C reste stable pendant environ 6 mois.

Au cours du transport, de petits volumes de produit peuvent parfois se retrouver piégés dans la bande scellée autour du bouchon du flacon. Pour les produits dont le volume est inférieur ou égal à 200 μl, il est recommandé de taper doucement le flacon sur une surface dure ou de le centrifuger rapidement dans une centrifugeuse de paillasse afin de déloger le liquide du bouchon.

Témoin
Expression cellulaire d'une protéine de fusion avec la GFP

Concentration : voir le certificat d'analyse du lot concerné.

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

Sauf indication contraire dans notre catalogue ou toute autre documentation associée au(x) produit(s), nos produits sont uniquement destinés à la recherche et ne sauraient être utilisés à d'autres fins, ce qui inclut, sans s'y limiter, les utilisations commerciales non autorisées, les utilisations diagnostiques in vitro, les utilisations thérapeutiques ex vivo ou in vivo, ou tout type de consommation ou d'application chez l'être humain ou chez l'animal.