Recombinase TAT-CRE

Chaque lot de TAT-CRE recombinase est testé selon un contrôle qualité rigoureux pour les paramètres suivants :

• Pureté : une seule bande autour de 41 kDa avec une pureté protéique supérieure à 70 % sur gel SDS-PAGE
• Activité fonctionnelle : induit la recombinaison des allèles modifiés par loxP dans une lignée de cellules à système rapporteur HEK293T-Cre
• Niveaux d'endotoxines : moins de 1 unité d'endotoxine (UE) par µg de protéine

EMD Millipore a mis au point une protéine de fusion TAT-CRE recombinase capable de pénétrer dans les cellules, pouvant être directement administrée aux cellules mammifères et produisant des rendements de recombinaison élevés (75 à 100 % chez la souris et environ 60 % chez les cellules humaines). TAT-CRE est facilement transloquée dans des cellules de mammifères et peut catalyser une recombinaison hautement efficace. La dose et le moment de l'exposition à Cre peuvent être contrôlés avec précision, ce qui permet de titrer soigneusement l'activité Cre.

La Cre recombinase est une enzyme du bactériophage P1 qui catalyse la recombinaison spécifique entre deux sites de reconnaissance d'ADN appelés sites loxP. Le site de reconnaissance loxP se compose de deux répétitions inversées de 13 pb encadrant une région d'espacement de 8 pb. Puisque le gène Cre et les sites loxP sont inexistants dans les génomes de la plupart des espèces, il est possible de concevoir et d'introduire des sites loxP dans les cellules cibles et ainsi de les utiliser pour contrôler précisément l'expression des gènes in vitro (c.-à-d. dans les cellules en culture) et in vivo (c.-à-d. dans les modèles animaux).

• Si les sites loxP sont situés sur des chromosomes différents, la Cre recombinase induira une translocation chromosomique.
• Si les sites loxP sont orientés dans des directions opposées, la Cre recombinase induira une inversion du segment encadré par les sites loxP.
• Si les sites loxP sont orientés dans la même direction, la Cre recombinase induira une délétion du segment encadré par les sites loxP.

De cette façon, le positionnement des sites loxP permet l'activation, la répression ou l'échange de gènes contre d'autres gènes.

La TAT-CRE recombinase d'EMD Millipore est une protéine de fusion recombinante capable de pénétrer dans les cellules, composée d'un peptide de translocation protéique de base dérivé du VIH-TAT (TAT), d'une séquence de localisation nucléaire (NLS), de la protéine Cre et d'une étiquette histidine (H6) N-terminale pour une purification efficace de la protéine à partir d'E. coli.

Il a été montré que la TAT-CRE recombinase d'EMD Millipore peut exciser efficacement les transgènes viraux STEMCCA dans les cellules iPS humaines et de souris.

Un étalon de 100 unités est défini comme étant la quantité de TAT-CRE (µg) pour 1,0 ml de milieu de culture tissulaire qui permet d'induire un taux de 50 % d'expression de la GFP dans un dosage sur la lignée cellulaire HEK293T avec système rapporteur loxP.

La protéine recombinante est fournie dans un tampon contenant 50 % de glycérol (v/v), 500 mM de NaCl et 20 mM d'HEPES à pH 7,4.

Stable entre -20 et -80 °C jusqu'à 3 mois à compter de la date de réception. Dès la première décongélation, centrifuger le flacon et mélanger délicatement la solution. Répartir en aliquotes de volumes de travail plus petits et congeler à -20 °C ou à -80 °C. Avant utilisation, diluer TAT-CRE à la concentration appropriée avec du milieu de culture et filtrer à travers un filtre pour seringue à faible adsorption protéique et ayant une dimension de pores de 0,2 µm (réf. Millipore SLGV 033 RS ou SLGV 013 SL).