Kit de marquage d′ARN à la digoxigénine (SP6/T7)

Kit permettant le marquage d'ARN à la digoxigénine-UTP par transcription in vitro à l'aide des polymérases SP6 et T7. Cette technique permet de produire des sondes d'ARN simple brin de longueur connue qui peuvent être utilisées dans divers procédés d'hybridation.

Durée du test : 145 minutes
Échantillons

• ADN plasmidique linéarisé
• Produit de PCR

Principe
Le kit de marquage d'ARN à la digoxigénine (DIG) produit des sondes d'ARN simple brin marquées à la digoxigénine de longueur connue. Une ARN polymérase SP6 ou T7 transcrit ces sondes in vitro à partir de l'ADN matrice (en présence d'UTP marqué à la digoxigénine).
Marquage d'ARN par transcription in vitro
L'ADN à transcrire est cloné dans le site de clonage multiple de vecteurs de transcription adaptés (p. ex. pSPT 18 ou 19), qui contiennent des promoteurs des ARN polymérases SP6 et T7. L'ADN matrice adjacent est linéarisé au niveau d'un site adéquat et les ARN polymérases sont utilisées pour produire des transcrits "run off". La sonde DIG-UTP est incorporée dans le transcrit. On trouve une sonde DIG-UTP tous les 20 à 25 nucléotides de l'ARN néosynthétisés. Puisque la concentration en nucléotides ne devient pas limitante dans la réaction de transcription classique, cette réaction permet de produire de grandes quantités d'ARN marqué.

Nous nous engageons à vous proposer des produits plus respectueux de l'environnement et conformes à au moins un des douze principes de la chimie verte. Ce produit chimique est conçu pour être plus sûr.  Le système DIG constitue une alternative à la radioactivité qui est à la fois sensible et rentable pour le marquage et la détection des acides nucléiques. De nombreux articles documentent la souplesse d'emploi du système DIG, montrant que le marquage radioactif n'est plus la seule solution envisageable pour le marquage de l'ADN en vue de son hybridation.

Principe du test : La matrice d'ADN à transcrire est clonée dans le site de clonage multiple de vecteurs de transcription adaptés, qui contiennent des promoteurs des ARN polymérases SP6 et/ou T7. Après linéarisation au niveau d'un site adéquat, l'ARN est transcrit en présence d'UTP marqué à la digoxigénine (DIG-UTP). En conditions normales, 1 μg de matrice donne environ 10 μg d'ARN complet marqué à la digoxigénine.

Ce kit permet le marquage de l'ARN avec une sonde DIG-11-UTP par transcription in vitro à l'aide des ARN polymérases SP6 et T7. Des transcrits "run off" marqués à la digoxigénine (DIG) sont synthétisés à haut rendement et peuvent être utilisés dans divers procédés d'hybridation :

• Northern blots
• Southern blots
• Hybridation in situ
• Transfert de plages de lyse ou de colonies
• Essais de protection à la RNase

En raison de leur forte spécificité et de leur haute sensibilité, les sondes marquées à la digoxigénine peuvent être utilisées pour la détection de gènes présents en copie unique dans 1 μg d'ADN humain total.
Remarque : Étant donné que la liaison entre la digoxigénine et l'UTP résiste aux bases, l'ARN marqué à la digoxigénine peut être fragmenté par traitement basique. Une légère réduction de la taille de la sonde d'ARN marquée à la digoxigénine peut en faire un outil plus adapté à certains procédés d'hybridation in situ.

Sensibilité et spécificité
Les sondes d'ARN marquées à la digoxigénine permettent de détecter des gènes présents en copie unique dans à peine 1 μg d'ADN de mammifère dans les conditions de test suivantes : le mélange d'hybridation contient 20 à 100 ng de sonde marquée par millilitre et la sonde liée est détectée à l'aide d'anticorps anti-digoxigénine couplés à la phosphatase alcaline et visualisée au moyen du substrat chimiluminescence CDP-Star.
Inactivation à la chaleur : Arrêter la réaction en ajoutant 2 μl d'EDTA 0,2 M (pH 8,0).

Produit destiné uniquement à la recherche en sciences de la vie. Ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic.

1 kit contenant 12 composants.