ββ-Glucuronidase/Arylsulfatase

βLa β-glucuronidase/arylsulfatase dérivée de Helix pomatia est la préparation d′enzymes à activité sulfatase la plus couramment utilisée et présente une large gamme de spécificité. Elle consiste en un mélange brut d′enzymes ; aucune étape de séparation chromatographique n′est utilisée lors de sa préparation. Cette préparation contient à la fois une activité glucuronidase et une activité sulfatase. Il est essentiel de procéder à une hydrolyse enzymatique avant la détection pour garantir une analyse de grande sensibilité. Après hydrolyse, l′échantillon peut être analysé par spectroscopie de masse, chromatographie en phase gazeuse, CLHP ou immuno-essais. Pour l′analyse des produits dopants, l′activité sulfatase en plus de l′activité glucuronidase est essentielle pour la détection de tous les conjugués de médicaments présents dans l′échantillon. βLa β-glucuronidase/arylsulfatase est également utilisée pour l′hydrolyse enzymatique des glucuronides et des esters de sulfate dans les liquides biologiques, principalement l′urine.

βLa β-glucuronidase/arylsulfatase a été largement employée par les laboratoires de recherche et d′analyse pour l′hydrolyse enzymatique simultanée des β-glucuronides et esters de sulfate. L′enzyme est utilisée pendant la préparation des échantillons pour cliver les glucuronides et esters de sulfate avant analyse par GC-MS, HPLC, immuno-essai ou toute autre méthode analytique, notamment l′analyse des produits dopants et l′hydrolyse des conjugués de stéroïdes (glucuronides) et d′esters de sulfate dans l′urine et les autres liquides biologiques.

βLa β-glucuronidase/arylsulfatase présente une large gamme de spécificité pour divers types de β-glucuronides et esters de sulfate.

Spécificité de la β-glucuronidase :
Les glycosides formés par l′acide β-D-glucuronique avec divers composés contenant des groupes hydroxyles s′hydrolysent facilement en présence de β-glucuronidase.

• Ces composés comprennent : des stéroïdes, comme l′œstriol (K_m = 0,42 mM, pH 4,5), l′androstérone, le prégnandiol, la tétrahydrocortisone,
• des phénols, comme la phénolphtaléine (K_m = 0,39 mM), le 4-nitrophénol, le 4-méthylumbelliférone,
• des médicaments, comme le chloramphénicol et les tétrahydrocannabinols,
• et des métabolites, comme la thyroxine et la bilirubine.

Les polysaccharides contenant des résidus d′acide β-glucuronique, comme l′acide hyaluronique, sont également hydrolysés.
βLa β-glucuronidase est hautement spécifique en ce qui concerne la portion glucidique : elle n′hydrolyse ni les α-glucosides, ni les acides β-glucosiduroniques. Cependant, la nature du résidu lié au résidu acide β-glucuronique n′a pratiquement pas d′importance.

Activité spécifique : 5,5 U/ml à +38 °C avec le substrat β-glucuronide de phénolphtaléine (4,5 U/ml à +25 °C avec le substrat 4-nitro-phényl-β-D-glucuronide = 100 000 unités de Fishman/ml à +38 °C avec le substrat β-glucuronide de phénolphtaléine). Une unité de Fishman libère, à partir de β-glucuronide de phénolphtaléine, 1 μg de phénolphtaléine par heure à 38 °C.

Spécificité de l′arylsulfatase :
Les esters de sulfate de nombreux phénols sont hydrolysés en présence d′arylsulfatase. Cela inclut par exemple les sulfates de stéroïdes, comme le sulfate d′œstrone, l′hydrogénosulfate de 4-nitrophényle (K_m = 1,8 mM, pH 7,3), le 2-sulfate de 4-nitro-pyrocatéchol (K_m = 1,25 mM, pH 7,5), et le disulfate de phénolphtaléine.

Activité spécifique : 2,6 U/ml à +38 °C avec le substrat disulfate de phénolphtaléine (14 U/ml à +25 °C avec le substrat sulfate de 4-nitrophényle = 800 000 unités de Roy/ml à +38 °C avec le substrat sulfate de 2-hydroxy-5-nitrophényle). Une unité de Roy libère 1 μg de sulfate de 2-hydroxy-5-nitrophényle par heure à 38 °C.

Spécificité de la β-glucuronidase :
Les glycosides formés par l′acide β-D-glucuronique avec divers composés contenant des groupes hydroxyles s′hydrolysent facilement en présence de β-glucuronidase.

• Ces composés comprennent : des stéroïdes, comme l′œstriol (K_m = 0,42 mM, pH 4,5), l′androstérone, le prégnandiol, la tétrahydrocortisone,
• des phénols, comme la phénolphtaléine (K_m = 0,39 mM), le 4-nitrophénol, le 4-méthylumbelliférone,
• des médicaments, comme le chloramphénicol et les tétrahydrocannabinols,
• et des métabolites, comme la thyroxine et la bilirubine.

Les polysaccharides contenant des résidus d′acide β-glucuronique, comme l′acide hyaluronique, sont également hydrolysés.
βLa β-glucuronidase est hautement spécifique en ce qui concerne la portion glucidique : elle n′hydrolyse ni les α-glucosides, ni les acides β-glucosiduroniques. Cependant, la nature du résidu lié au résidu acide β-glucuronique n′a pratiquement pas d′importance.

Spécificité de l′arylsulfatase :
Les esters de sulfate de nombreux phénols sont hydrolysés en présence d′arylsulfatase. Cela inclut par exemple les sulfates de stéroïdes, comme le sulfate d′œstrone, l′hydrogénosulfate de 4-nitrophényle (K_m = 1,8 mM, pH 7,3), le 2-sulfate de 4-nitro-pyrocatéchol (K_m = 1,25 mM, pH 7,5), et le disulfate de phénolphtaléine.

La glucurono-conjugaison est l′un des mécanismes fondamentaux du métabolisme. La plupart des substances entrant dans le corps humain subissent une transformation métabolique qui comprend une conjugaison avec l′acide glucuronique par l′UDP-glucuronosyltransférase (UGT). Cette enzyme catalyse le transfert d′un groupe glucuronyle vers de nombreuses molécules biologiques et pharmacologiquement actives endogènes et exogènes. Le glucuronide est en général plus soluble, moins toxique et plus facilement excrété par le corps humain que la molécule d′origine.
En outre, les médicaments et les substances chimiques peuvent être sulfatés dans l′organisme humain par des sulfotransférases. La sulfatation en général est moins prévisible que la glucurono-conjugaison, car il existe de nombreuses isozymes de sulfotransférases, avec des différences individuelles dans le taux de glucurono-conjugaison par rapport au taux de sulfatation des substances.

Solution en tampon salin, stabilisée

Concentration de travail : Pour de nombreuses applications, ce produit peut être dilué avec de l′eau immédiatement avant l′emploi ou utilisé non dilué.
Remarque : Cette préparation de β-glucuronidase/arylsulfatase est très concentrée et doit être diluée pour certaines applications. En outre, pour préparer des protoplastes, la concentration exacte à utiliser pour une souche de levure donnée doit être déterminée empiriquement.
Conditions de stockage (solution de travail) : Remarque : des portions aliquotes de la préparation diluée peuvent être conservées entre -15 et -25 °C ; elles ne doivent pas subir plus d′un ou deux cycles de congélation-décongélation et la durée de conservation à plus faible température n′est pas plus longue que celle du produit conservé entre 2 et 8 °C.

Éviter les congélations et décongélations répétées (plus de deux fois).

Glucuronidase :
Unité standard
L′unité standard de l′activité β-glucuronidase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μM le taux de libération de 4-nitrophénol à partir d′acide 4-nitrophényl-β-D-glucosiduronique à une température de +25 °C et un pH de 4,5.
Unité de phénolphtaléine
L′unité de phénolphtaléine de l′activité β-glucuronidase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μM le taux de libération de phénolphtaléine à partir de phénolphtaléine/acide β-D-glucosiduronique à une température de +38 °C.
Environ 4,5 unités standard sont équivalentes à 5,5 unités de phénolphtaléine.
Unité de Fishman
L′unité de Fishman de l′activité β-glucuronidase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μg le taux de libération de phénolphtaléine à partir de phénolphtaléine/acide β-D-glucosiduronique à une température de +38 °C.
Environ 1 unité standard est équivalente à 22 000 unités de Fishman (1 unité de phénolphtaléine est équivalente à 19 000 unités de Fishman).
Arylsulfatase :
Unité standard
L′unité standard de l′activité arylsulfatase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μM le taux de libération de 4-nitrophénol à partir de 4-nitrophényl sulfate à une température de +25 °C et un pH de 6,2.
Unité de phénolphtaléine
L′unité de phénolphtaléine de l′activité arylsulfatase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μM le taux de libération de phénolphtaléine à partir de disulfate de phénolphtaléine à une température de +38 °C et un pH de 6,2.
Environ 5,4 unités standard sont équivalentes à 1 unité de phénolphtaléine.
Unité de Roy
L′unité de Roy de l′activité arylsulfatase correspond à l′activité enzymatique qui permet d′augmenter de 1 μg le taux de libération de 4-nitropyrocatéchol à partir d′hydrogénosulfate de 2-hydroxy-5-nitrophényle (2-sulfate de 4-nitro-pyrocatéchol) à une température de +38 °C et un pH de 6,2.
Environ 1 unité standard est équivalente à 57 000 unités de Roy (1 unité de phénolphtaléine est équivalente à 308 000 unités de Roy).

EC 3.1.6.1 et 3.2.1.31

Pour la recherche en sciences de la vie uniquement. Ne pas utiliser dans des procédures de diagnostic.