クローニングと発現

タンパク質発現ベクター

プラスミド、すなわちタンパク質発現ベクターは、目的のタンパク質をクローニングおよび発現させるための数多くの機能要素を含む環状のDNA断片です。適切な発現ベクターの選択は、タンパク質の種類、そのタンパク質を発現させる宿主生物、そして研究者が取り組もうとする具体的な応用分野や科学的課題によって部分的に決定されます。利用可能な発現ベクターは多種多様であるため、研究者は自身の研究に最適なクローニング、クローン選別、およびタンパク質発現要素を選択することができます。 目的の遺伝子配列と発現ベクターが選定されると、研究者は通常、ヌクレアーゼを用いてベクターを特定の部位で正確に切断し、目的の遺伝子配列をフレームを崩さずにクローニングし、最終的に宿主生物内で発現させる。重要な点として、組換えDNAプラスミドは-70 °Cで凍結保存しても安定しているため、研究者は通常、化学的に感受性のある細胞と細菌形質転換法を用いて、これらを宿主として導入する。

細胞へのトランスフェクション方法

細胞トランスフェクションとは、DNAやRNA、あるいはタンパク質を真核細胞に導入するプロセスを指します。タンパク質発現ワークフローのこの段階を実現するために、研究者は物理的、化学的、生物学的なさまざまな技術を利用できます。 エレクトロポレーションなどの物理的手法や、リン酸カルシウム（CaPi）、ポリエチレンイミン（PEI）、リポフェクション試薬などの化学的手法は、いずれも研究者によって一般的に使用されています。また、レンチウイルス、オンコレトロウイルス、アデノウイルスを含むウイルス媒介システムも利用可能です。ただし、ウイルスによる導入法を使用する場合、バイオセーフティ上の理由から、追加の封じ込め対策やモニタリングが必要となることがよくあります。

タンパク質発現システム

研究者たちは、目的のタンパク質を発現させるために様々な生物を利用している。細菌は、発現ベクターを効率的に取り込み、倍加時間が短く、最適な条件下で高量の組換えタンパク質を産生できるため、研究者によって広く利用されている。 しかし、細菌は原核生物であるため、一部のタンパク質に必要な翻訳後修飾を行うことはできません。酵母や哺乳類細胞株を含む真核細胞は、タンパク質の翻訳後修飾を可能にするため、研究者によって広く利用されています。組換えタンパク質の発現に最適な細胞株の選択やタンパク質発現戦略は、具体的な用途のニーズや、研究者が解決しようとしている課題に大きく依存します。