発熱物質試験法

エンドトキシンは、グラム陰性菌に含まれる物質です。非エンドトキシン性発熱物質は、グラム陽性菌、ウイルス、酵母、真菌に由来するものを含む、その他の微生物由来の物質です。非微生物性発熱物質には、ゴム粒子、微細なプラスチック粒子、あるいはエラストマー中の金属化合物に由来するものもあります。

発熱物質の検出には、いくつかの試験法が利用可能です。これらは、検出対象となる汚染物質の種類や、試験の実施に動物由来の材料が必要かどうかによって分類することができ、その概要は以下の表に示されています：

ウサギによる発熱試験

ウサギ発熱原試験（RPT）は、試験対象製品をウサギに静脈内注射した後、その体温上昇を測定するものです。RPTは定性的な結果しか得られず、感度はかなり低いです。また、反復注射によるウサギの発熱原耐性の獲得や、試験実施時のウサギへのストレスなどにより、この試験の信頼性にも限界があります。

注：現在、欧州ではウサギ発熱原試験（RPT）が禁止されており、エンドトキシンおよび非エンドトキシン系発熱原の両方を検出するには、単球活性化試験（MAT）が推奨される方法となっている。

単球活性化試験

単球活性化試験（MAT）は、エンドトキシンおよび非エンドトキシン性発熱物質の両方を検出するための、動物を用いた方法に代わる手法である。単球活性化試験では、単球を試験サンプルとともにインキュベートすることで、ヒトの免疫反応を模倣する。発熱物質が存在する場合、単球が活性化され、発熱反応の原因となる炎症性分子であるサイトカインが産生される。 その後、特異的抗体と酵素による発色反応を用いた免疫学的測定法（ELISA）により、これらのサイトカインを検出します。 

注：2025年7月現在、欧州薬局方（Ph. Eur.）委員会は、エンドトキシンおよび非エンドトキシン性発熱物質の試験において、好ましい方法として単球活性化試験（MAT）の使用を推奨しています。ウサギ発熱物質試験（RPT）は、現在欧州で禁止されています。

本記事をお読みいただき、当社の専門家とさらに議論を深め、エンドトキシンおよび非エンドトキシン性発熱物質を検出するMATへの移行と、規制動向への対応を進めてください。 

細菌性エンドトキシン試験（LAL試験）

エンドトキシン試験で最も一般的な方法は、リムルス・アメーボサイト・ライセート試験（LAL試験）です。これは、カブトガニの血液中のアメーボサイトのライセートを用いたアッセイ法です。カブトガニの血液細胞由来のライセートは、凝固反応を通じて細菌性エンドトキシンと自然に反応します。この方法はエンドトキシンの定量において高い感度を有しますが、非エンドトキシン性発熱物質は検出できません。

組換えBET（r-FC、r-CR）試験

組換えファクターCは、通常、リムルスアメーボサイトライセートカスケードに含まれる遺伝子組み換えタンパク質である。この試験では、ファクターCがエンドトキシンと反応し、マーカーと結合して定量可能な蛍光性最終生成物を生成する。組換えファクターC試験はLAL試験と同じ原理を用いるが、動物由来の材料を必要としない。 

組換えカスケード試薬（r-CR）は、リムルスアメーボサイトライセートに見られる完全な凝固カスケードを再現する、遺伝子操作による多成分試薬です。この試験では、カスケードタンパク質である因子C、因子B、およびプロ凝固酵素が、エンドトキシンと順次反応し、定量可能な最終生成物を生成します。 r-CR試験は、動物由来の物質を必要とせずに、LAL経路全体を再現します。