LentiBrite ヒストン H2B-GFP レンチウイルスバイオセンサー

DNA とヌクレオソームの高次構造であるクロマチンは、真核細胞の核の大部分を構成しています。 クロマチン構造の変化は、転写、有糸分裂、減数分裂、アポトーシスなど、多くの重要な核プロセスの根幹をなすものです。 ヌクレオソームは、4 種類のコアヒストンタンパク質（H2A、H2B、H3、H4）の8量体から構成されています。 ヒストン H2B と蛍光タンパク質の遺伝子融合は、様々な過程における染色体構造の動態を可視化するために、生細胞において広く用いられてきました。 ヒストン H2B-GFP は正常な有糸分裂の研究に役立つだけでなく、癌原性二重微小染色体の非対称遺伝のメカニズムを明らかにするためにも利用されています。 また、ヒストン H2B-GFP をモニターすることで、アポトーシス中の染色体分解を連続的に分析することができます。 ヒストン H2B-GFP の使用は、近年、生動物や高スループット siRNA スクリーニングにも拡大されています。
EMD Millipore’のLentiBrite ヒストン H2B-GFP レンチウイルス粒子では、明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプで染色体の動態について生細胞分析が行えます。

バイオセンサーは、生きた状態の細胞に特定のタンパク質が含まれるかどうかを検出するだけでなく、そのタンパク質の細胞内部位を検出するためにも使用できます。細胞内目標タンパク質を可視化するための手法としては、蛍光顕微鏡検査あるいは低速度撮影ビデオキャプチャのいずれにおいても蛍光標識がよく用いられます。生細胞を破壊せずに可視化できれば、研究者はリアルタイムで細胞の状態を観察できるようになります。

レンチウイルスベクターシステムは、遺伝子産物を細胞に導入するために幅広く使用されている研究用ツールです。レンチウイルストランスフェクションは、化学に基づくトランスフェクションなどの非ウイルス的な手法、例えば分裂／非分裂細胞の高効率トランスフェクション、導入遺伝子の長期安定発現、および低免疫原性などよりも優れています。

EMD Milliporeは、LentiBriteレンチウイルスバイオセンサーをご紹介しています。これは、生細胞およびin vitro分析においてさまざまな細胞／疾患状態下で可視化を行うための、オートファジー、アポトーシス、および細胞構造に関連する重要で基本的なタンパク質をコードするパッケージ済みのレンチウイルス粒子製品群です。

• パッケージ済み、GFP & RFPを用いた蛍光タグ付き
• 従来の化学ベースのトランスフェクション法やその他のウイルス以外のトランスフェクション法と比較してトランスフェクション効率が高い
• 分裂細胞、非分裂細胞、および初代細胞または幹細胞などのトランスフェクションが困難な細胞にもトランスフェクト可能
• 細胞機能を破壊しない

EMD Millipore’のLentiBrite ヒストン H2B-GFP レンチウイルス粒子では明るい蛍光と正確な位置決定が得られ、トランスフェクトが困難な細胞タイプで染色体動態の生細胞分析が行えます。

蛍光顕微鏡イメージング：
（データシートの図1を参照）
HeLa細胞をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて20のMOIで24時間かけて導入を行いました。 培地を交換してさらに48時間培養してから、細胞をホルムアルデヒドで固定して標本化しました。 画像撮影は、オイルイマージョン広視野蛍光顕微鏡により行いました。ヒストン H2B-GFP は有糸分裂染色体にのみ結合しているものと考えられます。

その他の細胞タイプおよびトランスフェクト困難な細胞タイプ：
（データシートの図 2 を参照）
20 の MOI で形質導入した U2OS 細胞。 上の細胞は分裂終期の染色体、下の細胞は分裂後期の染色体 。 40 の MOI で 24 時間形質導入した HT1080。 2つの核は間期期にある。初代細胞タイプあるヒト間葉系幹細胞（HuMSC）をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて 40 の MOI で 24 時間かけて導入を行いました。3つの核は間期にあります。

様々な有糸分裂期にある、トランスフェクトが困難な細胞タイプ：
（データシートの図 3 を参照）
初代細胞タイプ HUVEC をチャンパースライドに塗布し、レンチウイルス粒子を用いて 20 の MOI で 24 時間かけて導入を行いました。画像は有糸分裂の様々な段階にある細胞を示しています。

最適な蛍光の可視化のため、最適な生細胞分析のために、トランスフェクション／感染後 24 ～ 48 時間以内に標的発現レベルを分析することをお勧めします。これは、特にトランスフェクトが困難な細胞株では蛍光強度が経時的に低下する可能性があるためです。感染細胞は、トランスフェクション／インフェクションが正常終了したら凍らせて、さらに培養液中で融解すれば、24～48時間が経過しても陽性蛍光発現が維持されます。 蛍光発現の長さと強度は、細胞株によって異なります。トランスフェクションが困難な細胞株には、より高いMOIが必要になる場合があります。

研究カテゴリー
アポトーシス & 癌
エピジェネティクス & 核機能

研究サブカテゴリー
アポトーシス-追加

細胞周期、DNA複製 & 修復

PEG沈殿

保管および取扱い
レンチウイルスは、-80°Cで保存した場合に受領日から最低4カ月間安定です。 初回の融解後は速やかに氷上に置き、実用アリコートは-80°Cで凍結してください。 凍結アリコートは最低2ヵ月間保存できます。 これ以上凍結融解すると、ウイルス力価と導入効率の低下を招くおそれがあります。

安全性に関する重要事項
本製品に添付されている第3世代ベクターなどの複製欠損レンチウイルスベクターが、ヒトや動物で何らかの疾患を引き起こすことは知られていません。 しかし、レンチウイルスは一体化して宿主細胞ゲノムを形成する可能性があるため、挿入型変異のリスクをもたらすおそれがあります。 原料はリスクグループ2であり、BSL2管理下で取り扱う必要があります。 レンチウイルスベクターのバイオセーフティーに関する詳細な考察は、Pauwels, K. et al. (2009). State-of-the-art lentiviral vectors for research use: Risk assessment and biosafety recommendations. Curr. Gene Ther. 9: 459-474.

HT-1080細胞を導入し、蛍光画像処理によって標的局在化と導入効率を判定することにより評価しました。

ヒストン H2B-TagGFP2 レンチウイルス：
1バイアルに、1 mLあたり少なくとも3 x 10E8感染単位（IFU）のレンチウイルス粒子を25 µL含む。
ロットに固有の力価情報については、データシートの製品仕様に記載されているロットごとの“バイアル力価”をご覧ください。


プロモーター
EF-1（延長因子-1）


感染多重度（MOI）
MOI = 感染している細胞の数に対する感染レンチウイルス粒子の数（IFU）の比率。
高い導入効率とシグナル強度が得られる一般的なMOI値は、20～40の範囲です。 この標的の場合は、さらに低いMOIが必要になる細胞タイプ（HT-1080、HeLa、ヒト間充織幹細胞［HuMSC］など）もあれば、さらに高いMOIが必要になる細胞タイプ（ヒト臍帯静脈内皮細胞［HUVEC］、U2OS など）もあります。
注：必要な導入効率とシグナル強度が得られるように、MOI値は各細胞タイプとレンチウイルス標的ごとにご自身で決定して最適化してください。

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