ChemiScreen 膜製剤 組換えヒト CB₂ カンナビノイド受容体

カンナビノイド化合物には、Cannabis sativa（ 大麻）の主な精神活性成分である D9-THC のような外因性薬物と、エイコサノイドファミリーに属するアナンダミドのような内因性媒介物質が含まれます。カンナビノイドの生物学的作用は、2 種類の Gi 結合型 7-膜貫通型受容体である CB1 と CB2 によって媒介されます。 CB1 受容体は主に脳内に存在し、カンナビノイドリガンドの精神作用に関与します。 CB2受容体は、主に肥満細胞やCD40活性化B細胞などの免疫細胞に発現し、増殖や遊走抑制を媒介します（Howlett et al., 2002）。 CB2の活性化は肝線維症の発症を抑制します（Julien et al., 2005）。 骨においては、CB2は骨芽細胞と破骨細胞の両方に発現し、骨量の減少を防ぐ機能を有しています（Ofek et al., 2006）。 さらに、CB2の活性化は、神経障害性、炎症性、急性の各疼痛動物モデルにおいて抗侵害受容効果を示し、この効果は末梢における内因性オピオイドの放出によって媒介されます（Ibrahim et al., 2005）。 Millipore′の EP2 膜製剤は、安定性組換え細胞株から作成された粗製膜製剤です。GPCR の表面発現が高レベルであるため、CB2 のアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングするのに理想的な HTS ツールです。 この膜製剤は [3H]-CP55,940 に対して 2.7 nM の Kd を示します。 5 μg/ウェル CB2 膜製剤と 2.5 nM [3H]-CP55,940を用いると、10 倍以上のシグナル／バックグラウンド比が得られます。

全長ヒト CB2

インキュベーション条件
アッセイ推奨条件：非結合 96-ウェルプレート内で、膜を放射性リガンドおよび非標識競合物質（試験濃度については図 1 および 2 を参照）と結合緩衝液中で混合し、1～2時間インキュベートします。ろ過の前に、FC 96 ウェル採取プレート（Millipore カタログ番号 MAHF C1H）を 0.33% ポリエチレンイミンで 30 分コーティングし、50mM HEPES、pH7.4、0.5% BSA で洗浄します。 結合反応をフィルタープレートに移し、洗浄緩衝液で 3 回洗浄します（1 回の洗浄につき各ウェル 1 mL）。 プレートを乾燥させ、カウントします。

結合緩衝液：50 mM HEPES、pH 7.4、5 mM MgCl₂、1 mM CaCl₂、0.2% BSA、ろ過後、4°C で保存。

放射性リガンド：[³H]-CP55940（Perkin Elmer #NET1051）

洗浄緩衝液：50 mM HEPES、pH 7.4、500 mM NaCl、0.1% BSA、ろ過後、4°Cで保存。

各パッケージには、少なくとも 200 アッセイ（ユニット）分の膜が収められています。1 ユニットとは、2.5 nM の 3 H標識 CP55,940 で 10 倍以上のシグナル：バックグラウンドが得られる膜の量を意味します。

パッケージ緩衝液中の液体：50 mM トリス、pH7.4、10% グリセロール、1% BSA、保存料無添加。
包装方法：膜タンパク質は包装緩衝液中で指示濃度に調整し、急速凍結して -80°C で保存したものです。

表1. さまざまな量の CB2 膜製剤を用いた競合結合アッセイで得られたシグナル：バックグラウンドおよび特異的結合値。

	10 µg/ウェル	5 µg/ウェル
シグナル：バックグラウンド	33.5	25.2
特異的結合（cpm）	7336	6207

仕様：1 ユニット = 5 μg 膜製剤
Bmax：50 pmol/mg
Kd： 2.7 nM

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany