細胞増殖キットII（XTT）

細胞増殖キットII（XTT）は、細胞増殖、生存率、および細胞毒性の非放射活性定量のための比色分析法です。サンプルには、96ウェルマイクロプレートに接着あるいは懸濁させた培養細胞のどちらでも使用できます。

比色分析法は、培地に添加されたテトラゾリウム塩の開裂によって、生細胞の数を測定します。本テクニックは、微小培養において洗浄や細胞の回収を必要としない完全アッセイであり、ELISAリーダーによってデータ解析でき、同じマイクロプレート内で実施できます。
最近では、テトラゾリウム塩XTTが報告されています。MTTとは異なり、XTTの開裂生成物は水に可溶であるため、可溶化のステップは必要ありません。テトラゾリウム塩XTTは、複雑な細胞内メカニズムによってホルマザンに開裂されます。この生物還元反応は生細胞のみに起こり、解糖系を通じたNAD（P）Hの生成に関与しています。そのため、生成されたホルマザン色素の量は、代謝的に活性のある培養細胞の数に直接相関します。

細胞増殖キットII（XTT）は、96ウェルプレート形式を使用した細胞集団中の細胞増殖および生存率の非放射活性分光光度定量に使用されます。本キットは以下のことに使用できます：

• 成長因子、サイトカイン、マイトジェンおよび栄養素に対する細胞増殖の測定
• 抗癌剤や他の医薬品化合物などの、細胞毒性および細胞増殖抑制化合物の分析
• 成長阻害抗体や生理学的メディエーターの評価
• 骨細胞増殖のための、骨組織エンジニアリングを採用した、様々な足場の生物適合性試験
• 細胞生存率アッセイ。

本アッセイは、電子カップリング試薬の存在下での、テトラゾリウム塩XTTの開裂に基づき、可溶性のホルマザン塩を生成します。この変換は生細胞のみに起こります。96ウェル組織培養プレートで増殖した細胞を、XTTラベリング混合物で2～20時間インキュベーションします。インキュベーション後、生成されたホルマザン色素は、スキャンニングマルチウェル分光光度計（ELISAリーダー）を使用して定量されます。測定された吸光度は、生細胞数と直接相関します。
細胞増殖および生存率アッセイは、細胞生物学におけるルーチンアプリケーションとして特に重要です。テトラゾリウム塩（例、MTT、XTT、WST-1）は、このタイプの分析に特に有用です。テトラゾリウム塩は、ミトコンドリアの呼吸鎖に属するコハク酸-テトラゾリウム還元酵素システム（EC 1.3.99.1）によって開裂され、ホルマザンを生成し、これは代謝的に活性のある細胞だけに起こります。

1つのキットには2のコンポーネントが含まれています。

使用液：溶液の調製
XTTラベリング試薬および電子カップリング試薬を、それぞれ37°Cの水浴内で解かします。各バイアルを十分に混合し、透明な溶液を得ます。
XTTラベリング混合物
1つのマイクロプレート（96ウェル）で細胞増殖アッセイ（XTT）を実施するためには、5 mLのXTTラベリング試薬と0.1 mLの電子カップリング試薬を混合します。
注意：信頼性のある結果を得るためには、XTTラベリング試薬と電子カップリング試薬を、使用直前に解かして混合してください。
実施要領
細胞を、1ウェルあたりの最終液量が100 μLとなるようにマイクロプレート（組織培養グレード、96ウェル、平底）内で、加湿雰囲気下（例、37°C、6.5％ CO₂）、細胞に必要な培地に従い培養します。
細胞培養のインキュベーション期間は、アッセイに使用する実験アプローチや細胞株によって異なります。ほとんどの実験セットアップにおいて、細胞のインキュベーション時間は、24～96時間が適切です。
インキュベーション後、上記のように調製したXTTラベリング混合物を、各ウェルに50 μL加えます（XTTの最終濃度は0.3 mg/mL）。
マイクロプレートを、加湿雰囲気下（例、37°C、6.5％ CO₂）で、4～24時間インキュベートします。
注意：インキュベーション時間は、それぞれの実験セットアップ（例、使用する細胞の種類や濃度）によって異なります。そのため、XTTラベリング混合物の添加後に、1つの同じマイクロプレートを使用して異なるタイムポイント（例、4、6、8、12、および18時間）で吸収を測定し、特定の実験セットアップにおける最適なインキュベーション時間を決定することをお勧めします。
保管条件（使用液）：試薬は使用直前に解かしてください。適切に分注することをお勧めします（5 mLのXTTラベリング試薬と0.1 mLの電子カップリング試薬が、1つのマイクロプレート（96ウェル）でのアッセイに必要です）。
注意：凍結融解の繰り返しは避けてください。

ライフサイエンス研究のみに使用できます。診断には使用できません。