細胞および微小組織の研究に向けたマイクロおよびナノ加工生体材料

はじめに

生体材料科学では、生物学の研究、管理、または模倣のため、スマート材料の設計および作製を行います。生物学の研究では、生体材料の統合に成功するためには生体システムについて有意義な理解が要求されます。さらに、材料科学と生物学の境界領域であるため、多くの場合、材料科学の飛躍的な進展が生物学の進歩の引き金となります。その結果、マイクロおよびナノテクノロジーの進展により、細胞および微小組織に関する理解が大幅に深まっています。本稿では、細胞および多細胞システムに関連する生体材料の興味深い進展を紹介します。

細胞レベル：蛍光プローブと無機プローブ

細胞レベルでは、生物学的なイベントやシグナルの可視化および定量化のために最も一般的に使用されているツールの1つが蛍光プローブです。蛍光タンパク質を利用した指示薬は、細胞内の区画を標的化することができ、単純な有機色素より多様な組織および無処置の生物に取り込ませることができます。さらに、蛍光プローブは、高い時空間分解能を維持しながら、引き起こされる光力学的毒性が有機色素と比較して低減します。多くの蛍光プローブはクラゲAequorea victoria に由来し（AFP）、その一部の例を挙げると、緑色蛍光タンパク質（GFP：green fluorescent protein、Roche製品番号：11814524001）、赤色蛍光タンパク質（RFP：red fluorescent protein）、および青色蛍光タンパク質（CFP：cyan fluorescent protein）などあります。このようなプローブを考案することにより、生細胞内での複雑な過程を研究するツールが得られています。ただし、急速な光退色や塩素イオンの変動およびpHに対する感受性が高いため、より安定なAFP変異体の開発が進められています¹。その例の1つがサンゴ緑色蛍光タンパク質（CGFP：coral green fluorescent protein）で、輝度や幅広い発光および励起ピークは不十分ですが、高い耐pH性があり、酸性の細胞小器官の標識化に最適です。AFPは、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence Resonance Energy Transfer）に基づく指示薬として特に価値があります。FRETは、2個の蛍光体が相互に隣接（80 Å）し、供与体の発光スペクトルが受容体の励起帯と重なる時に起こります。受容体対供与体の蛍光の比率が、細胞内の生化学的イベントを測定するための読み取り値として用いられます。蛍光プローブの改善が続けられており、生細胞の生物学に新たな成果をもたらしています。例えば、新世代の非常に高感度な近赤外蛍光プローブは、タンパク質の立体構造における微妙な変化を検出できる可能性があり、AFP系レポーターの検出限界および適用性が改善されるかもしれません²。さらに、1細胞および1分子イメージングは、既存の手法では困難な、細胞間の変動を明確にして個別の分子間相互作用を可視化できます。

蛍光に基づくプローブの代替として、金ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、および量子ドット（QD：quantum dot）などの無機ナノ粒子は、反応時間および溶媒を変えることで多様なサイズ、形状、収率で合成することが可能です。無機ナノ粒子の合成法として、マイクロエマルション、熱分解、水熱法、ソルボサーマル法などがあります³。まとめると、このような粒子は、蛍光イメージング、磁気共鳴画像法、細胞標的化、薬物送達など、さまざまな生物医学用途に使用されています³。腸管吸収の研究では、Simovicらが、疎水性のリン脂質コアと親水性のPEGコロナからなるナノ粒子の物理化学的性質およびin vivo の薬物送達能力の特性を評価しています（図1）。このPEG化リン脂質ナノ粒子は、薬物を含まない粒子に近いサイズ分布を維持しながら、水に不溶な抗がん剤を可溶化して保持することが可能です⁴。特に注目すべきはQDで、最近では細胞分子生物学で用いる方法として普及しています。QDは半導体のコア（CdまたはSe）とシェル（ZnS）で構成され、有機蛍光色素と比較して光学的特性が大幅に向上しています。QDのコアのサイズは調節可能であり、狭い発光ピークと広い励起スペクトルを広範囲にわたって得ることができます。これらの特性のため、QDは1分子追跡（SPT：single-molecule tracking）、蛍光マルチプレックス、およびFRETに大変適しています。SPTにおけるQDの使用により、細胞表面の受容体のダイナミクスに関する理解が深まっています。例えば、水で安定化したQDを使用して、生細胞において受容体依存性エンドサイトーシスによる輸送イベントが蛍光顕微鏡で追跡されています⁵。ただし、FRET供与体としてのQDの使用は、まだ新しい技術です。より高輝度で小型のQDの作製が進展することで、SPTとFRETの手法の併用が可能になり、膜受容体のダイナミクス、活性化、および輸送の分野に変革がもたらされると予想されます⁵。

細胞レベル：細胞間相互作用

イメージング以外では、スマート材料およびセンサーの進展により、細胞とその環境の間の物理的な力に関する研究が促進されています。細胞–細胞間および細胞–マトリックス間の相互作用に関係する力の定量化により、外部から内部への物理的キューのフィードバックおよび細胞挙動への影響におけるその役割への理解が深まっています。最初に、Harrisらは、細胞遊走およびそれに伴う周囲マトリックスへの力を研究するために、柔らかいシリコーン基板上で細胞を培養するシステムを開発しました⁶。この柔らかい基板により、細胞がシリコーン基板に及ぼすすべての力を、基板表面のしわの形成として可視化することが可能です。マイクロニードルとカウンターウェイトを併用してこのしわを再現することで、表面にかかるせん断力を計算することができます⁶。

現在、細胞の力を研究するための技術は遥かに高度化しています。さまざまな形態の力顕微鏡法が存在し、細胞間または周囲マトリックスに対して細胞が及ぼす力をより定量的に測定することが可能です。牽引力顕微鏡法（TFM：Traction Force Microscopy）は、Harrisらにより開発されたシステムの進化形です。3次元以上を分析する能力などのTFMの進展により、従来の基板面内のせん断牽引だけでなく、細胞が及ぼす内側への力を研究する可能性が開かれています⁷。図2に示すように、Legantらは、TFMを使用して3次元（3D）内で細胞が及ぼす力を測定するためのシステムを開発しました⁷。各細胞の近くに蛍光ビーズがあるPEGハイドロゲル（既知の機械的性質）にGFP発現細胞がカプセル化されました。周囲マトリックス内のビーズの変位を追跡することで、線形弾性理論および有限要素法を用いて細胞の牽引力を計算することが可能になりました⁷。この強力なツールにより、細胞–マトリックス間相互作用を時空間的に定量化することが可能になり、さまざまな細胞型、細胞–リガンド間相互作用、そして多細胞間相互作用を今後研究するための多くの可能性が開かれています。

細胞–マトリックス間相互作用を研究するために使用される別の方法として、細胞接着力顕微鏡法（CAFM：Cell Adhesion Force Microscopy）があります。当初は、無生物の物体を表面から移動させるために必要な力を測定する目的で設計された方法ですが、細胞–基板間の接着力の研究に転用されました。Sagvoldenらによって開発されたこのシステムは、傾斜した原子間力顕微鏡法（AFM：Atomic Force Microscopy）のカンチレバーおよびレーザーを使用して、基板に接着した細胞を移動させるために必要な力を測定します⁸。倒立顕微鏡と併用することで、CAFMでは接着した細胞を移動させる際の力曲線を生成することができます⁸。このシステムでは、ゲル-ビーズ構造体が不要であり、一般的な2次元（2D）細胞培養装置と容易に統合することができます。ただし、CAFMでは、TFMがもたらす優れた時空間分解能および3D測定は得られません。

当然ながら、細胞力学を研究するために用いる技術の多くは他の研究分野から転用されたものです。例えば、光ピンセットはマイクロメートルサイズの粒子に対する力を検出するために物理学分野で開発されましたが、細胞力学の研究にも転用されています。具体的には、光ピンセットおよびマイクロビーズを使用して、細胞外マトリックスの機械的性質が細胞表面タンパク質に与える効果を研究することが可能です。Choquetらは、リガンド被覆ラテックスマイクロビーズを操作してマウス線維芽細胞との相互作用を研究するために、初めて光ピンセットを使用しました⁹。この装置では、細胞力に応答した個別のマイクロビーズの移動を追跡し、接着した細胞からビーズを分離するために必要な力を精密に測定することが可能になりました⁹。また、Wangらも、マイクロビーズと磁気ツイストサイトメトリーを用いて細胞–リガンド相互作用を研究しています。機械的負荷を変えることで特定のインテグリンに対して与える効果について、リガンド被覆強磁性マイクロビーズを使用して研究が行われました¹⁰。この研究のシステムでは、光ピンセットの代わりに強磁場が強磁性マイクロビーズに印加されました。マイクロビーズを湾曲させるため、直交する第2の弱い磁場が追加されました¹⁰。こうすることで、光ピンセットと比較してより高い処理量で細胞集団に対する機械的負荷を実現することが可能です。したがって、このシステムで多細胞間相互作用を研究できる可能性があります。

マイクロビーズの操作に加えて、マイクロパッドも、細胞とその環境の間の相互作用に関して理解を深めるために使用できます。Galbraithらは、ラミニンで被覆したマイクロメートルサイズのパッドをカンチレバーに取り付けた力測定装置を構築しています（図3）。線維芽細胞から発生した力にパッドが応答し、その変位が測定されました。カンチレバーの既知の機械的性質と合わせて、この装置によって細胞が発生させた力の精密な定量化が可能になりました¹¹。

細胞間相互作用を理解するためのマイクロ構造の使用は、物理的な力の研究に限ったものではありません。図4に示すように、Pinneyらは、マイクロロッドおよびマイクロキューブが心細胞の線維化に影響を与えることを実証しました¹²。細胞と相互作用する微小環境を変化させることで、薬物の投与なしに治療反応が得られる可能性があります¹²。同様に、ナノチューブ被覆が内皮の治癒を促進すると同時に、平滑筋細胞の増殖を減少させることが示されています¹³。これらのマイクロ構造およびナノ構造を用いた細胞間相互作用の研究により、細胞機能に対する物理環境の影響について理解を深めることができます。

先端的な材料および技術を巧みに利用することで、細胞間相互作用に関する理解が深まっています。ナノスケールおよびその先の方法論の開発が続くのに伴い、複雑な生物学的問題に答えられる機会が増えていくことでしょう。

微小組織レベル：特性評価

微小組織内の細胞間相互作用の精密な特性評価は、組織工学の進展を支えるために不可欠です。バイオセンサーは細胞レベルの生物学の特性評価で大幅な前進を遂げていますが、その感度および分解能は多細胞構造体の複雑性に関する独創的な研究にも適用されています。例えば、蛍光プローブは、組織または3D構造物の最小限の混乱しか必要としないため、多細胞構造体における細胞表現型または生化学シグナル伝達イベントの特異的な特性評価にも非常に適しています。例として、多細胞スフェロイドの中心における細胞死の研究があります。多細胞スフェロイドは、多細胞微小組織の研究に使用される重要なin vitroモデルです。Wartenbergらは、共焦点レーザー走査顕微鏡法を用いて、多細胞グリオーマスフェロイドにおける細胞生存率を決定しました¹⁴。蛍光色素の拡散、光散乱、および吸収が大きな制約となっており、データの拡大解釈のおそれはありますが、蛍光プローブは依然として、細胞または微小環境に影響を及ぼさずに多細胞構造体の形状および生存率の特性を評価するための最善のアプローチです。

また、無機マイクロ粒子およびナノ粒子も、組織レベルのセンシングおよびイメージングにおける汎用性および有用性が実証されています。脂質二重層被覆シリカナノ粒子を使用すると、さまざまなバイオセンシング用途における蛍光色素の機能性改善に対して大きな効果があります¹⁵。一般的には、シリカマイクロスフェアの存在下でリポソームが破裂してマイクロスフェアの周囲に融合することで、脂質二重層被覆が形成されます。多孔性シリカマイクロスフェアを使用して、内部の細孔表面に蛍光体を組み込むことができます（図5）。支持された脂質二重層をもつマイクロスフェアがpH応答性色素を保護し、周囲媒体のpHが高い場合でも蛍光強度を維持できることを示した研究があります.¹⁵。また、金ナノ粒子はほとんどの有機分子色素より強い吸収および散乱を示します¹⁶。これらの利点とサイズに依存する光学的および光温熱性から、金ナノ粒子はin vivoイメージングに適した造影剤になります。金ナノ粒子、金ナノシェル、ナノケージ、およびナノロッドは、深さ数センチメートルまでヒト組織に浸透できる近赤外（NIR）光を吸収することが可能です。近赤外光を吸収した後、金ナノ粒子は周囲の組織に放熱するため、イメージング、がん治療、および腫瘍焼灼術といった用途が創出されています¹⁶。

組織工学における無機粒子の応用は、注目する価値があります。Saldanhaらは、磁気共鳴画像法（MRI：magnetic resonance imaging）を用いて関節軟骨再生をモニタリングするため、酸化鉄粒子を使用して間葉系幹細胞（MSC：mesenchymal stem cell）の標識化および追跡を行いました¹⁷。移植前に超常磁性酸化鉄によるMSCの標識化を行うことで、移植された細胞集団の縦断的で非侵襲的なin vivoの体内分布評価を容易に行うことができます（図6B）。この研究の結果は、多種多様な用途において細胞ベースの組織工学的方法をモニタリングする手法の開発が必要であることを強調しています。

微小組織レベル：バイオセンサー

微小組織の特性評価以外では、バイオセンサーの進歩においてマイクロおよびナノテクノロジーが積極的に利用されています。酵素または抗体活性を検出するための認識素子として、または他の認識素子を送達する足場として、有機微粒子および分子がバイオセンサーとして機能するように設計することが可能です。HIV抗体、細菌性成分、がんにおけるEGFRやアルツハイマー病患者のアミロイド班のような疾病状態の分子を検出するために、蛍光体、QD、またはナノ粒子にコンジュゲーションさせたペプチドまたはタンパク質が使用されています¹⁸。一般的に、バイオセンサー用途のポリマー系微粒子は球体およびカプセルとして作製されます。よく使用されるポリマーの1つである乳酸グリコール酸共重合体（PLGA：poly(lactic-co-glycolic acid)）はダブルエマルション法で形成され、親水性または疎水性の積荷を取り込むことが可能です。Nehillaらは、増強イメージングおよび薬物放出の用途のため、QDおよび薬物を搭載したPLGAナノ粒子を作製しました（図6A）¹⁹。

ナノ粒子系担体としての用途の他に、ポリマー自体がバイオセンサーとして機能するように設計することが可能です。一般的な刺激応答性ポリマーとして、pNIPAM²⁰、pHEMA²¹、およびpVA-pAa²²などがあります。これらのポリマーを、ハイドロゲル、ポリマーブラシ、および分子的にインプリントされたポリマーコーティングに組み込むことで、細胞レベル（DNA、FRET、抗体フラグメント）または多細胞レベル（pH、グルコース、酸素）で被験物質の変化を検出することが可能です²³。また、オリゴヌクレオチドもバイオセンサーのプラットフォームとすることができます。一般的には、物理吸着、化学的架橋、または共有結合による付着により、一本鎖DNA（ssDNA：single-stranded DNA）をガラス、ポリマー、金ナノ粒子などの表面に固定します。DNAのリン酸基を使用して、正に帯電した被験物質または色素分子を検出することができます（図6C）²⁴。さらに、抗体検出およびシグナル増幅のため、DNA、低分子、およびタンパク質を検出する分子ビーコンとして機能する二次構造をDNA鎖に形成させることが可能です（図6C、左図）²⁴最後に、ssDNAとその相補鎖は、DNAに向けた新規の抗体²⁵および多細胞組織²⁶のアセンブリに利用することができ、バイオセンシングおよび組織の特性評価においてさらなる研究に使用することが可能です²⁷（図6C、右図）。

結論

生物学および工学において、細胞や組織をin vitroで研究するためにマイクロおよびナノテクノロジーが有用なツールであることは明らかです。ただし、生体システムの研究に使用される生体材料の物理化学的性質が、システム自体の構造や機能性に影響を及ぼす可能性があるということが広く認識されるようになっています。したがって、このような材料を使用することの限界および注意事項を理解することが重要です。例えば、多細胞レベルでは、組織を収容してin vitroでモニタリングするためのプラットフォームが、組織の反転などの現象を引き起こし、生物学的性能を損なう可能性があります²⁸。このような現象がなぜ、どのように起こるのか、そのメカニズムはまだ完全には理解されていません。ただし、材料科学と生物学が相互依存的な進展を続ければ、多数の有益な答えとそれに続く興味深い課題が生まれることは確実です。