HPLCおよびUHPLC分析用純水
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）は、確立された信頼性の高い手法であり、多くの研究室において主力となる分析法となっています。堅牢な手法とはいえ、HPLCは使用する試薬の品質に大きく影響を受けます。HPLCにおいて最も重要な試薬の一つが水です。これは、特に逆相HPLCにおいて、水がHPLCの移動相の主要な構成要素となることが多いためです。水に含まれる不純物は、HPLCの結果や装置の性能に直接影響を及ぼす可能性があります。
HPLCの概要
HPLCは、分析化学において最も強力な手法の一つです。HPLCは、液体に溶解可能な多種多様な試料中に含まれる、幅広い極性を持つ化合物を分離、同定、定量することができます。この手法は感度が高く、汎用性にも優れており、医薬品、環境、臨床、法医学、食品、栄養補助食品、工業用化学物質など、ほぼあらゆる種類の試料に適用可能です。
原則
HPLCでは、カラムに充填された固定相と、カラム内をポンプで送り込まれる液体の移動相との間に分析対象物質が分配されることで、分離が行われます。試料中の成分は固定相とそれぞれ異なる相互作用を示し、その極性、電荷、サイズ、または親和性に基づいて分離されます。分子がカラムから流出すると、UV、蛍光、質量分析、またはその他の検出器によって検出されます。
HPLCシステムは、適切なチューブや継手で接続された6つの基本モジュール、すなわち溶媒タンク、ポンプ、インジェクター、カラム、検出器、およびデータシステムで構成されています（図1）。
図1。HPLC装置の概略図
超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）
超高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）は、より微細な固定相粒子（UHPLCでは2 µm未満、HPLCでは一般的に3～5 µm）とより高い圧力（UHPLCでは最大1500 bar、HPLCでは300～600 bar）を利用することで、HPLCよりも短い分析時間、高い感度、高い分解能、および優れた再現性を実現します。 さらに、UHPLCでは平衡化時間と分析時間が短縮されるため、サンプルあたりの溶媒消費量が少なくなります。この技術は、ハイスループット試験、複雑なサンプルの分析、あるいはサンプル量が限られている場合に最適な手法です。また、HPLCに比べて分離が速く、溶媒消費量も少ないため、グリーンケミストリーの分野でもますます利用されています。より高い圧力が必要となるため、UHPLCには高いシステム圧力に対応できる装置が必要です。
この「HPLCメソッド転送計算ツール」を使用すると、HPLCからUHPLC条件へメソッドを転送する際に、実行時間と溶媒消費量の削減量を算出できます。
HPLCの分離モード
HPLCによる分離は、試料の物理化学的特性に基づいて行うことができます：
通常相クロマトグラフィー（NP-HPLC）
通常相HPLCでは、固定相は極性（例：シリカ）であり、移動相として比較的非極性の溶媒（例：ヘキサン、酢酸エチル）が使用されます。この古典的なクロマトグラフィー法は、天然物、脂質、糖類、その他の極性化合物の分離に一般的に用いられます。このクロマトグラフィー法では、通常、水は使用されません。
逆相クロマトグラフィー（RP-HPLC）
逆相HPLCは、通常相とは逆の仕組みです。通常相よりも一般的であり、分離の75％以上を占めています。逆相HPLCでは、カラムには疎水性粒子（例えば、C18結合シリカ）が充填されています。 移動相は、水（または酸や塩基、緩衝液で調整した水）と、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒とを任意に混合したものです。この手法は非常に汎用性が高く、低分子医薬品、ペプチド、ヌクレオチド（DNA/RNA断片）、農薬、保存料など、非極性または中程度の極性を持つ化合物の分離に広く用いられています。
イオン交換クロマトグラフィー（IEX-HPLC）
イオン交換クロマトグラフィーは、固定相とのイオン相互作用に基づいて荷電分子を分離するために用いられる強力な手法である。固定相には、一定の電荷を持ち、反対の電荷を持つイオンを引き付ける陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂が用いられる。 移動相は通常、水溶液または緩衝液です。分離は、分析対象物質が樹脂に引きつけられる力の強さに依存しますが、これは分析対象物質の電荷および電荷密度に基づいています。
サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）
サイズ排除クロマトグラフィー（ゲル浸透クロマトグラフィーとも呼ばれる）は、溶液中の分子のサイズに基づいて分子を分離するために用いられる手法である。 カラムには、所定の細孔径を持つ多孔質のビーズ（例：アガロース）が充填されています。大きな分子はビーズの細孔に入ることができないため、移動距離が短くなり、細孔内を長距離移動する小さな分子よりも先に検出器に到達します。この方法は、タンパク質、高分子、ウイルス粒子、ナノ粒子などの分子を分離するために使用されます。
アフィニティークロマトグラフィー
アフィニティクロマトグラフィーは、生物学的相互作用に基づいて、複雑な混合物から特定の分子を精製するために用いられる、非常に選択性の高い手法です。また、受容体の研究にも利用されます。カラムには、分析対象物質特異的または基団特異的なアフィニティリガンドでコーティングされたアガロースビーズが充填されています。分析対象物質は、非常に特異的な方法でリガンドを認識し、結合します。その後、pHやイオン強度の変更、あるいは競合リガンドの添加によって、標的分子が溶出されます。
疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）
HICは、生物学的活性を維持したままタンパク質やタンパク質複合体を精製するために用いられます。分子は疎水性に基づいて分離されます。試料は高塩濃度緩衝液中で注入され、塩濃度を徐々に低下させることで分子が溶出されます。この手法は、疎水性の分析対象分子部分と疎水性の固定相リガンドとの相互作用の程度に基づいて、分析対象を分離します。
水中の汚染物質がHPLCに及ぼす影響
HPLCにおいて最もよく見られる問題の一つは、溶媒／移動相の品質に関連しています。（この記事でヒントやコツをご覧ください。）水は、特に逆相HPLCにおいて、HPLCの移動相の主要な成分となることが多いため、慎重に選定する必要があります。また、ブランクとして、試料前処理や標準曲線の作成にも使用されます。
水中の不純物は、いくつかの点でHPLC分析やHPLC装置に影響を及ぼす可能性があります。
有機物
HPLCで使用される水に含まれる有機物の混入は、クロマトグラフィー分離にさまざまな影響を及ぼす可能性があります：
ノイズの多いベースラインやベースラインのドリフトを引き起こしたり、対象化合物と共溶出したりして、同定や定量を困難にすることがあります。その結果、クロマトグラフィー分離に使用する水中の有機物の存在により、分析クロマトグラフィー法の感度が低下する可能性があります。
有機物はカラムのヘッドに蓄積し、その後、汚染物質やゴーストピークとして溶出することがあります。
有機物の混入レベルが非常に高い場合、保持時間のシフト、ピーク形状の歪み、およびピークのテーリングを引き起こす可能性があります。これにより、分離能が低下し、同定や定量が困難になります。また、実験の再現性にも影響を及ぼします。
カラム内への有機物の蓄積は、物質移動の問題を引き起こし、分離能の低下や、最終的にはカラムの寿命短縮につながる可能性があります。
これらの理由から、HPLC用途に使用される水中の有機物の濃度を正確に監視することが極めて重要であり、これはTOCモニターまたはTOCインジケーターを用いて容易に行うことができます。1
粒子
粒子は、ポンプやインジェクターを損傷する可能性があります。また、カラムやフリットを詰まらせ、背圧の上昇を引き起こすこともあります。さらに、粒子は二次的な固相として振る舞い、試料成分を吸着する恐れもあります。
UHPLC では、粒子径が小さく、間隙容積が小さく、カラム径が小さく、流速が高いため、粒子の影響はより顕著になります。非常に微細な粒子で充填されたカラムは、より大きな粒子で充填された HPLC カラムに比べて、粒子による早期の目詰まりを起こしやすくなります。
コロイド
コロイドは固定相に不可逆的に吸着し、それによってカラムの本来の分離効率が低下する可能性がある。
細菌
細菌はカラムやフリットに侵入し、有機副生成物を放出する可能性があります（有機汚染の影響を参照）。
イオン
イオン汚染もクロマトグラフィー分離に影響を与える可能性があります。溶液のイオン強度の変化は、一部の分離に影響を与える可能性があり、イオン汚染物質が UV を吸収するイオン（例：硝酸イオン、亜硝酸イオン）である場合、ピークとして現れ、データ解析を困難にします。
研究：再現性のあるUHPLC分析における水質の重要性
UHPLCでは、試料の希釈、標準溶液、および移動相の調製に水が使用されます。UHPLCに低品質の水を使用すると、データの品質やシステムの性能に、即時的および長期的な悪影響を及ぼす可能性があります。有機汚染物質は、UHPLCクロマトグラムの品質に最も大きな影響を与える可能性のある不純物であり、ゴーストピーク、ノイズの多いベースライン、あるいは再現性の低下を引き起こします。また、保持時間の漸進的な変化や分解能の低下を引き起こす可能性もあります。
Milli-Q®超純水がUHPLC分析に適していることを実証するため、7種類の化合物の混合物をグラジエント溶出法（3分間で水80％／アセトニトリル20％から水10％／アセトニトリル90％へ変化させ、その後1分間等度条件を維持し、さらに初期条件に戻す）を用いて繰り返し分析した。
Milli-Q® IQ 7003 超純水システムと同様の、Millipak® 最終フィルターを装備した Milli-Q® 純水および超純水システムを使用しました。
600 回連続の注入を通じて、保持時間、ピーク面積、およびピーク形状は安定しており、超純水によって検出可能な有機汚染物質が混入していないことが示されました。図 2 は、1 回目の実行と 600 回目の実行のクロマトグラムを比較したもので、これらがほぼ同一であることから、この堅牢性が示されています。
これらの結果は、精製したばかりのMilli-Q®超純水が、信頼性が高く再現性のあるUHPLCの性能を確保するのに役立つことを裏付けています。2
図2。7つの化合物の混合物の254 nmにおけるUHPLCクロマトグラム。 A：初回分析；B：600回目の分析。 （1：2-アセチルフラン、2：アセタニリド、3：アセトフェノン、4：プロピオフェノン、5：ブチルパラベン、6：ベンゾフェノン、7：バレロフェノン）