무혈청 세포 배양 조건에서 인간 유도만능줄기세포의 대장 오가노이드로의 체외 분화

오가노이드는 종종 줄기세포에서 유래된 복잡한 자가 조직화된 3차원 세포 배양 모델이다.¹ 오가노이드는 뇌,² 장,³ 위,⁴ 대장,⁵ 간,⁶ 췌장,⁶ 폐,⁷ 신장⁸ 및 환자 유래 종양 등 다양한 조직에서 생성되었다.⁹ 상피성 장 오가노이드는 종종 엔테로이드(enteroids) 또는 미니 장(mini-guts)으로 불리는 상피성 장 오가노이드는 위장관의 생리적 특성을 유지하며, 대장암, 체강 질병, 염증성 장 질환 및 숙주 미생물군 상호작용 연구를 포함한 장 발달 및 질환 모델링에 유용한 세포 배양 도구로 활용되어 왔다.¹⁰ Clevers 등이 개발한 전통적 분리 기술¹은 마우스 또는 확보가 어려운 인간 조직 샘플로부터의 긴 1차 조직 분리 과정에 의존한다. 유도 만능 줄기 세포 유래 오가노이드는 더 다양한 인간 기증자로부터 환자 특이적 세포 모델을 신속하게 생성할 수 있게 할 것이다. 머크는 고도로 특성화되고 분석 준비가 완료된 냉동 보존된 인간 대장 오가노이드 및 증식 배지를 제공하는 인간 iPSC 유래 대장 오가노이드 시스템을 개발했습니다. 또한, 머크의 최적화된 무혈청 배지 및 시약은 간단한 3단계 분화 과정을 통해 모든 인간 iPS 세포주에서 대장 오가노이드를 유도하는 데 사용할 수 있습니다.

오가노이드 배양 프로토콜

단계 1: 인간 iPS 세포의 확정 내배엽 분화 (0-4일차)

참고: 약 70-80% 접합 상태이며 분화 세포가 5% 미만인 고품질 미분화 인간 ES/iPS 세포(SCC271)로 시작하십시오. 다음 프로토콜은 6웰 조직 배양 처리 플레이트의 한 웰 분화를 위한 것입니다. 표시된 용량은 단일 웰 기준입니다. 필요에 따라 용량을 조정하십시오.

1. 단일 세포 배양용 배지를 준비합니다. ROCK 억제제(ROCKi) Y-27632(SCM075)를 인간 ES/iPS 확장 배지(SCM130) 7-10mL에 최종 농도 10µM이 되도록 첨가합니다.
2. 6-웰 플레이트에 ECM 젤(CC131-5ML)을 코팅합니다.
3. 배지를 흡입 제거합니다. DMEM/F12 또는 1X PBS 2mL로 웰을 세척합니다. 흡입 제거 후 Accumax™ (A7089) 1mL를 웰에 첨가합니다. 37°C에서 5-6분간 배양합니다. 세포를 분리하기 위해 플레이트를 손바닥에 단단히 두드립니다.
4. 단일 세포 배양액(1단계에서 준비) 1mL를 웰에 첨가합니다. 5mL 피펫으로 1-3회 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
5. 분리된 세포를 15mL 원추형 튜브에 수집합니다. 웰에 단일 세포 배양 배지 1mL를 추가하고 잔여 세포를 모두 수집하여 세포 현탁액이 담긴 15mL 원추형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 140 x g에서 5분간 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
6. 세포 침전물을 1mL의 단일 세포 배양액에 재현탁합니다. 트리판 블루(T8154)와 혈구계수판을 사용하여 총 생존 세포 수를 계수합니다.
7. ECM 젤(CC131-5ML)로 코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 1x10⁶ 세포를 첨가합니다. 사용 배지는 단일 세포 배양 배지(1단계에서 사용한 것)여야 하며, 총 용량은 웰당 3mL입니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
8. 웰에서 배지를 흡인 제거합니다. 웰에 최종 내배엽 유도 배지(SCM302) 2mL를 첨가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
9. 2일차와 3일차에도 8단계를 반복합니다. 4일차에 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 2단계로 진행하기 전에, 세포는 내배엽 마커 CXCR4, c-Kit, Sox-17, FOXA2에 대해 85% 이상 양성 반응을 보이고 PDGFR에 대해서는 음성 반응을 보여야 합니다.

2단계: 후장 내배엽 분화 (4~8일차)

1. 4일차 확정 내배엽 배양물이 담긴 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다.
2. 각 웰에서 배지를 흡입 제거합니다.
3. 각 웰을 3mL의 1X PBS로 세척합니다.
4. 각 웰에 예열된 후장 유도 배지(SCM303) 2mL를 첨가합니다.
5. 플레이트를 즉시 37°C, 5% CO_₂ 인큐베이터로 옮겨 24시간 동안 배양합니다.
6. 2~5단계를 총 5일간 반복합니다.
7. 후장 내배엽 분화 5일차는 CDX2 발현을 확인하는 중요한 시점입니다. CDX2 발현이 60% 이상이어야 단계 3으로 진행할 수 있습니다. CDX2 발현이 60% 미만일 경우, 후장 분화를 하루 더 진행한 후 CDX2 발현을 재확인하십시오.

3단계: 대장 오가노이드의 확장 및 냉동 보존 (8-48일차)

대장 오가노이드 증식

1. 8일차 후장 내배엽 배양물이 담긴 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다.
2. 각 웰에서 배지를 흡인합니다.
3. 각 웰을 1X PBS 3mL로 세척합니다.
4. 예열된 3dGRO™ 인간 대장 오가노이드 증식 배지(SCM304) 2mL를 각 웰에 첨가합니다.
5. 플레이트를 즉시 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터로 옮겨 48시간 동안 배양합니다.
6. 분화 12일차까지 2일마다 3dGRO™ 인간 대장 오가노이드 확장 배지(SCM304)로 배지를 교체합니다.
   
   참고: 12일차 말에 대장 구형체가 형성되며, 3dGRO™ 인간 대장 오가노이드 확장 배지(SCM304)를 사용하여 Matrigel^® 매트릭스에 매립하여 성숙한 대장 오가노이드를 생성합니다.
   
   
7. Human Colon Organoid Expansion Media (SCM304)에 최종 농도 10 µM의 ROCKi Y-27632 (SCM075)를 첨가합니다.
8. 성장 인자 감소 매트릭젤을 4°C에서 하룻밤 또는 얼음 위에서 충분한 양을 해동합니다.
9. 대장 상피 세포 분화 12일째에 인큐베이터에서 세포를 제거하고 배지에 떠 있는 스페로이드를 15mL 원추형 튜브에 모읍니다.
10. 각 웰을 3mL의 1X PBS로 세척합니다.
11. 스페로이드가 포함된 단층 배양(부유하지 않는 스페로이드)을 1mL의 Accumax(A7089)로 분리하고 37°C에서 5-10분간 배양합니다.
12. 단층이 느슨해지면 P-1000 피펫으로 세포를 4~5회 부드럽게 피펫팅하고, 1mL의 세포 현탁액을 위의 9단계에서 준비한 원추형 튜브로 옮깁니다.
13. 4°C에서 265 x g로 5분간 원심 분리합니다.
14. 상층액을 흡입하고 1X PBS 4mL로 한 번 세척합니다.
15. 265 x g, 4 °C에서 5분간 원심 분리한 후 상층액을 제거합니다.
16. 원추형 튜브 바닥을 가볍게 두드려 침전물을 분리합니다.
17. 매트리지^® 매트릭스를 TC 후드에 넣고 신속하게 1mL를 취해 16단계에서 분리된 세포 펠릿에 첨가합니다.
18. 900 µL로 설정된 P-1000 피펫을 사용하여 Matrigel^® 매트릭스에서 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁시킵니다. 재현탁 과정에서 기포가 발생하지 않도록 주의하십시오.
19. 겔화를 방지하기 위해 즉시 세포 현탁액을 얼음 위에 5분간 두십시오.
20. 1mL의 Matrigel^® 매트릭스/세포 현탁액을 신선한 Matrigel^® 매트릭스로 1:50~1:100의 비율로 희석하고, 24-웰 플레이트의 각 웰에 50µL/돔을 시드합니다(예: 1:100 희석의 경우, 18단계에서 얻은 매트릭스/세포 10µL에 신선한 매트릭스 40µL를 혼합합니다. 50µL/웰을 접시에 배양합니다). 아래 그림 4를 참조하십시오.
21. 24-웰 플레이트를 즉시 37 °C에서 10분간 배양합니다.
22. 돔이 젤화되면 1mL의 3dGRO™ 인간 결장 오가노이드 확장 배지(SCM304) + 10µM ROCKi(SCM075)를 첨가합니다.
23. 배지는 2일마다 신선한 3dGRO™ 인간 대장 오가노이드 확장 배지(SCM304) 1mL로 교체할 수 있습니다.
24. 3dGRO™ 오가노이드 분해 시약(SCM300)을 사용하여 1:3에서 1:4의 분할 비율로 10-12일마다 오가노이드를 분화시킬 수 있습니다.

대장 오가노이드의 냉동 보존

인간 대장 오가노이드는 3dGRO™ 오가노이드 동결 배지(SCM301)를 사용하여 냉동 보존할 수 있습니다. 본 프로토콜은 냉동 보존을 위한 인간 대장 오가노이드 배양 시 분해 시약을 전혀 사용하지 않는 방식을 기반으로 합니다. 각 바이알당 권장 시작 돔 수는 4개이며, 각 돔의 밀도가 90%라고 가정합니다. 밀도가 90% 미만인 경우 바이알당 더 많은 돔을 냉동 보존하십시오.

1. 오가노이드를 냉동 보존을 위해 패시징할 준비가 되면 인큐베이터에서 플레이트를 꺼냅니다.
2. P-1000 피펫을 사용하여 각 Matrigel 매트릭스 돔을 기존 1mL 배지 내에서 5회 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다.
3. 오가노이드 현탁액을 원추형 튜브로 옮깁니다.
4. 10mL 피펫을 사용하여 원추형 튜브 벽을 따라 10회 피펫팅하여 오가노이드를 계속 분산시킵니다.
5. 원추형 튜브를 265 x g ~ 700 x g로 원심 분리합니다.
6. 상층액을 흡입하고 1X PBS 1mL로 펠릿을 재현탁시킵니다.
7. P-1000 피펫을 사용하여 오가노이드 펠릿을 위아래로 20회 피펫팅하여 계속 분산시킵니다.
8. 오가노이드 현탁액에 1X PBS 5mL를 첨가하고 4°C에서 700 x g로 5분간 원심 분리합니다. 상층액에 잔여 오가노이드 조각이 남아 있는 경우 추가로 5분간 원심 분리합니다.
9. 상층액을 흡입하고 1mL의 3dGRO™ 오가노이드 동결 배지(SCM301)로 펠릿을 재부유시킵니다.
10. P-1000 피펫으로 펠릿을 5회 재현탁한 후, 바이알당 4개의 돔에 필요한 나머지 냉동 배지 1mL를 첨가합니다.
11. 냉동 보존 바이알의 세포를 냉동 용기(예: Mr. Frosty)로 옮긴 후 -80°C 냉동고에 24~72시간 동안 보관합니다.
12. 냉동 보존된 인간 대장 오가노이드를 액체 질소 탱크로 옮겨 장기 보관합니다.

결과

그림 6. 인간 대장 오가노이드의 면역세포화학(ICC) 특성 분석. 인간 iPS 세포 유래 대장 오가노이드는 CDX2, α-탄산탈수효소-II, α-탄산탈수효소-IV, 뮤신-5B, 뮤신-2 및 E-카데린에 대해 양성 반응을 보인다.

결론

머크는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSCs)로부터 인간 대장 오가노이드를 생성하기 위한 견고한 3단계 분화 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 대장 오가노이드는 성숙한 대장 표지자인 CDX2, α-탄산 탈수 효소-II, α-탄산 탈수 효소-IV, 뮤신 5B, 뮤신 2 및 E-카데린을 발현하며, 대장 표현형을 잃지 않고 여러 번의 연속적인 배양을 견딜 수 있습니다. 이러한 오가노이드와 무혈청 배지는 연구자와 신약 개발자에게 장 질환 연구를 위한 검증된 새로운 3차원 세포 모델을 제공할 것입니다.