인간 유도만능줄기세포의 체외 분화를 통한 호흡기 질환 연구 적용을 위한 기도 상피 폐 오가노이드 생성

• 폐 오가노이드 분화 프로토콜
• 기도 상피 폐 오가노이드 문제 해결 가이드

폐 오가노이드는 인간 폐 발달 및 바이러스 감염(SARS-CoV, H1N1, MERS), 낭포성 섬유증, 천식/만성폐쇄성폐질환(COPD), 대기 오염 노출, 흡연의 영향 등 호흡기 질환 연구에 유용한 3차원(3D) 세포 배양 모델입니다. 기존의 불멸화된 폐 세포주 및 1차 세포와 달리, 폐 오가노이드는 다양한 분화 세포 유형과 복잡한 조직 구조를 포함하여 생체 내 조직 및 기능성과 더 유사합니다. 또한 폐 오가노이드는 소량의 환자 조직이나 다능성 줄기세포로부터 유도될 수 있어 맞춤형 생물의학 연구를 용이하게 하는 생체 생물은행을 구축할 수 있습니다.

3dGRO™ 인간 폐 오가노이드 배양 시스템은 혈청이 없는 다단계 배양 시스템으로, 인간 유도 만능 줄기세포(iPS)를 체내의 분지된 기도 및 초기 폐포 구조와 구조적으로 유사한 성숙한 폐 오가노이드로 효율적으로 분화시킵니다. 3dGRO™ 인간 폐 오가노이드 배양 시스템을 사용하면 성숙한 폐 및 기도에서 발견되는 다양한 세포 유형을 나타내는 적절한 표지자를 발현하는 다량의 성숙한 폐 오가노이드를 생성할 수 있습니다. 여기에는 II형 폐포 상피세포(ATII)에서 발견되는 SFTPB 및 SFTPC(표면활성제 단백질 B 및 C), 기도 궤양세포에서 발견되는 MUC5AC, EpCAM, Sox9 및 Nkx2.1(폐 내배엽), 아세틸-α-튜불린(섬모 세포), 그리고 중간엽 마커인 비멘틴을 포함합니다. 또한 폐 오가노이드는 COVID-19를 유발하는 신종 SARS-CoV-2 바이러스의 수용체인 안지오텐신 전환 효소 2(ACE2)와 SARS-CoV-2 바이러스 침입을 촉진하는 세린 프로테아제인 TMPRSS2도 발현합니다.

폐 장기유사체 분화 프로토콜

단계 1: 인간 iPS 세포의 확정 내배엽 분화 (0-4일차)

참고: 약 70-80%의 접합도를 가지며 분화 세포가 5% 미만인 고품질 미분화 인간 ES/iPS 세포(SCC271)로 시작하십시오. 다음 프로토콜은 6웰 조직 배양 처리 플레이트의 한 웰에 대한 분화를 위한 것입니다. 표시된 용량은 단일 웰 기준입니다. 필요에 따라 용량을 조정하십시오.

1. 단일 세포 배양용 매체를 준비합니다. ROCK 억제제(ROCKi) Y-27632(SCM075)를 인간 ES/iPS 세포 확장 매체(SCM130) 7-10mL에 최종 농도 10µM이 되도록 첨가합니다.
2. 6-웰 플레이트에 ECM 젤(CC131)을 코팅합니다.
3. 배지를 흡입 제거합니다. DMEM/F12 또는 1X PBS 2mL로 웰을 세척합니다. 흡입 제거 후 Accumax™ 용액(A7089) 1mL를 웰에 첨가합니다. 37°C에서 5-6분간 배양합니다. 세포를 분리시키기 위해 플레이트를 손바닥에 단단히 두드립니다.
4. 단일 세포 배양액(1단계에서 준비) 1mL를 웰에 첨가합니다. 5mL 피펫으로 1-3회 위아래로 피펫팅하여 세포를 분리합니다. 기포가 생기지 않도록 주의합니다.
5. 분리된 세포를 15mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. 웰에 단일 세포 배양 배지 1mL를 추가하고 잔여 세포를 모두 수집하여 세포 현탁액이 담긴 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 튜브를 140 x g에서 5분간 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
6. 세포 침전물을 1mL의 단일 세포 배양액에 재현탁합니다. 자동 세포 계수기 또는 트리판 블루(T8154)와 혈구계수기를 사용하여 총 생존 세포 수를 계수합니다.
7. ECM 젤(CC131)로 코팅된 6-웰 플레이트의 각 웰에 1x10⁶ 세포를 첨가합니다. 사용 배지는 단일 세포 배양 배지(1단계에서 사용한 배지)여야 합니다. 총 용량 = 웰당 3mL. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
8. 웰에서 배지를 흡입 제거합니다. 웰에 최종 내배엽 유도 배지(SCM302) 2mL를 첨가하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
9. 2일차와 3일차에도 8단계를 반복합니다. 4일차에 유세포 분석기로 세포를 분석합니다. 2단계로 진행하기 전에, 세포는 내배엽 마커 CXCR4, c-Kit, Sox-17 및 FOXA2에 대해 80% 이상 양성 반응을 보이고 PDGFR에 대해서는 음성 반응을 보여야 합니다.

단계 2: DE 세포의 전방 전장 내배엽 세포 분화 (4-8일차)

참고: 확정 내배엽 세포 배양 4일차와 전방 전장 내배엽(AFE) 세포로 분화 후 8일차 모두에서 높은 세포 밀도가 관찰되어야 합니다. 아래 프로토콜은 6-웰 플레이트 기준의 참고 배양 밀도를 제공합니다. 다른 플레이트 형식에 맞게 배양 밀도를 조정하십시오.

1. 4일차 확정 내배엽 배양을 포함한 6-웰 플레이트를 인큐베이터에서 꺼냅니다.
2. 각 웰의 배지를 흡입 제거합니다. 각 웰을 1X PBS(BSS-1006-B) 2mL로 세척합니다.
3. 확정 내배엽 세포를 분해하기 위해 웰당 Accumax™ 용액(A7089) 1mL를 첨가합니다. 37°C에서 6-8분간 배양합니다.
4. 5분 후 플레이트를 육안으로 확인합니다. 세포를 더 분리시키기 위해 플레이트 가장자리를 가볍게 두드립니다. 대부분의 세포가 현탁액 형태로 분리되어야 합니다. 그렇지 않은 경우 2분 더 배양합니다.
5. AccuMax™ 용액(A7089)을 희석하기 위해 웰당 1X PBS(BSS-1006-B) 2mL를 첨가합니다. 세포 현탁액을 50mL 원추형 튜브에 모읍니다. 각 웰에 1mL의 1X PBS로 세척하여 잔여 세포를 수집하고 50mL 원추형 튜브에 추가합니다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 여러 번 위아래로 피펫팅합니다.
6. 실온에서 세포 현탁액을 130 x g로 5분간 원심분리합니다.
7. 상층액을 제거합니다. 세포 침전물을 AFE 유도 배지 I(SCM305) 2mL에 재현탁합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구계수기를 사용하여 세포 수를 계수합니다.
   6-웰 플레이트에 PBS 내 4 µg/mL 농도의 피브로넥틴(F0895)으로 코팅합니다. 웰당 희석된 피브로넥틴 1.5 mL를 첨가합니다. 코팅된 접시를 2-8 °C에서 하룻밤 동안 보관합니다. 코팅 용액을 제거합니다. 후드 내에서 뚜껑을 열고 5분간 공기 건조시킵니다. 플레이트가 건조되면 뚜껑을 덮고 세포 준비가 완료될 때까지 보관합니다.
8. 피브로넥틴 코팅된 6-웰 플레이트에 웰당 1X10⁶ 세포를 접종합니다. 각 웰에 총 2mL가 되도록 적절한 양의 AFE 유도 배지 I(SCM305)을 첨가합니다.
9. 플레이트를 37°C 인큐베이터에 넣습니다. 플레이트를 좌우 및 앞뒤로 부드럽게 흔들어 세포가 웰 표면에 고르게 분포되도록 합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
10. 5일차: AFE 유도 배지 II(SCM306) 2mL를 웰당 교체합니다. 37°C에서 24시간 배양합니다.
11. 6일차: 배지를 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307)로 웰당 2mL씩 교체합니다. 37°C에서 24시간 배양합니다.
12. 7일차: 웰당 2mL의 3dGRO™ 폐 오르가노이드 분지 배지(SCM307)로 교체합니다. 37°C에서 24시간 배양합니다.
13. 8일차: AFE 세포는 융합 영역과 세포 군집/집합체가 교차하는 형태학적 변화를 보여야 합니다. 성숙한 폐 오가노이드로 추가 분화시키기 위한 프로토콜을 따릅니다. 잉여 AFE 세포는 바이알당 3-6 x 10⁶ 세포 농도로 3dGRO™ 오가노이드 동결 배지(SCM301)를 사용하여 냉동 보존할 수 있습니다. 

단계 3: AFE 세포의 폐 싹 오가노이드 분화 (8-25일차)

1. AFE 세포가 융합된 층을 포함하는 6-웰 플레이트의 각 웰에서 세포를 흡인하고 신선한 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307) 1mL를 첨가합니다.
2. 5 mL 피펫을 사용하여 각 웰의 표면을 따라 부드럽게 긁어 단일 세포층을 응집체 형태로 분리합니다. 단일 세포로 분쇄되지 않도록 주의하십시오. 6웰 플레이트의 1개 웰에서 분리된 세포 응집체를 Costar^® 초저 부착 24웰 플레이트(CLS3473)의 웰로 옮깁니다.
3. 잔여 세포를 수집하기 위해 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) 0.5mL를 추가하고, 저부착성 24-웰 플레이트의 세포가 있는 웰에 넣으십시오. 총 용적 = 약 1.5mL 세포 현탁액. 37°C에서 배양하십시오.
4. 20-25일까지 격일로 배지를 교체합니다. 오가노이드는 부유 배양 상태이므로 배지 교체 시 다음 프로토콜을 따릅니다:
   1. 1mL 유리 혈청용 피펫을 사용하여 부유 오가노이드를 멸균된 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 10분간 기다립니다.
   2. 진공 펌프에 2 mL 흡입 피펫을 연결합니다. 2 mL 흡입 피펫에 멸균된 20 µL 비장벽 피펫 팁을 부착합니다. 배지를 조심스럽게 흡입합니다. 오가노이드를 교란하지 않도록 완충 역할을 하는 소량의 배지를 오가노이드 상부에 남겨두도록 주의합니다.
   3. 오가노이드 펠릿이 담긴 15mL 튜브에 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307) 0.5mL를 첨가합니다. 1mL 유리 피펫으로 위아래로 두 번 피펫팅합니다. 오가노이드를 초저부착 24웰 플레이트의 동일한 웰로 다시 옮깁니다.
   4. 15mL 원뿔형 튜브에 0.5mL 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307)를 추가하여 잔여 오가노이드를 씻어내고 수집합니다. 씻어낸 용액을 초저부착 24웰 플레이트의 동일한 웰에 추가합니다. 총 용량 = 웰당 1mL.

단계 4: 폐 싹 오가노이드(LBO)의 성숙한 폐 오가노이드로의 분화 (25-60일차)

1. 성장 인자 감소형 Matrigel^® 매트릭스(Corning Cat. No. 354230)를 얼음 위에서 해동합니다.
2. 멸균 핀셋을 사용하여 멸균된 24-웰 인서트(Corning Cat. No. 353095)를 조직 배양 처리되지 않은 24-웰 플레이트(Corning Cat. No. 351147)로 옮깁니다. 각 웰에 하나의 인서트를 사용합니다.
3. 각 인서트에 차가운 100% 성장 인자 감소형 Matrigel^® 매트릭스 50 µL를 분주한다. Matrigel^® 매트릭스가 고형화되도록 5분간 기다린다.
4. 동시에, 부유하는 폐 싹 오가노이드(LBO)가 담긴 웰 하나를 60mm 페트리 접시로 옮깁니다. 별도의 96-웰 U-바텀 플레이트에서 각 웰에 3dGRO™ 폐 오가노이드 성숙 배지(SCM308) 60µL를 첨가합니다.
     참고: 20~25일차에는 많은 부유형 폐 오가노이드가 생성됩니다(그림 3). 각 Matrigel^® 샌드위치에는 약 4~6개의 오가노이드가 포함되어야 합니다. 제작할 Matrigel^® 샌드위치 수를 계산하여 오가노이드/Matrigel^® 현탁액 준비에 필요한 96-웰 플레이트의 총 웰 수를 결정하십시오.
5. 멸균 해부 후드 내에서 멸균된 20 µL 피펫 팁을 10 µL 용량으로 설정하여 60 mm 배양 접시에서 접힌 오가노이드 6개를 선택하여 96-웰 U-바닥 플레이트의 1개 웰로 옮깁니다. 
6. 96-웰 플레이트를 해부 후드에서 조직 배양 후드로 옮깁니다.
   참고: Matrigel^® 매트릭스의 조기 겔화를 방지하기 위해 한 번에 3개 이하의 인서트를 준비할 것을 권장합니다.
   1. 단계 5의 96-웰 플레이트 각 웰에 차가운 100% 성장인자 감소(GFR) Matrigel^® 매트릭스 60 µL를 첨가합니다. 피펫팅을 여러 번 하여 부드럽게 혼합하고 기포가 발생하지 않도록 주의합니다. 총 용량 = 웰당 130 µL.
   2. 즉시 장기유사체-GFR Matrigel^® 매트릭스 혼합물(약 130 µL)을 단계 3에서 준비한 24-웰 플레이트의 각 인서트 중앙으로 옮깁니다. 
   3. Matrigel^® 매트릭스가 고형화될 때까지 5분간 기다립니다.
   4. 총 6개의 샌드위치가 처리될 때까지 반복합니다.
7. 인서트 상단에 차가운 100% 성장 인자 감소(GFR) Matrigel^® 매트릭스 75 µL를 추가하여 Matrigel^® 샌드위치를 만듭니다. Matrigel^® 샌드위치가 완전히 굳도록 24-웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 최소 30분 동안 두십시오. 6개 이상의 샌드위치를 삽입해야 하는 경우, 4~7단계를 반복하십시오.
8. 각 인서트 위에 500 µL의 3dGRO™ 폐 오르가노이드 성숙 배지(SCM308)를 추가하고, 인서트 아래 웰에 500 µL를 추가합니다.
9. 배지는 격일로 교체하십시오. 
   1. 진공 펌프에 2mL 흡입 피펫을 연결합니다. 2mL 흡입 피펫에 멸균된 20µL 비장벽 피펫 팁을 부착합니다. Matrigel^® 샌드위치 상부와 인서트 하부의 배지를 조심스럽게 흡입합니다.
   2. 각 인서트 위에 500 µL의 3dGRO™ 폐 오가노이드 성숙 배지(SCM308)를 첨가하고, 인서트 아래 웰에 500 µL를 첨가합니다.

기도 상피 폐 오가노이드 문제 해결 가이드

문제 1: D20-25에 폐 봉오리 오가노이드(LBO)를 Matrigel^® 샌드위치로 이식한 후 2주 경과 시 분지 구조나 폐포 구조가 관찰되지 않습니다.

1. 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307) 및 3dGRO™ 폐 오가노이드 성숙 배지(SCM308)에는 온도와 빛에 민감한 성분이 포함되어 있습니다.  계획된 실험에 따라 분량을 준비하고 반복적인 동결/해동을 피하십시오. 매뉴얼의 "보관 및 안정성" 섹션의 지침을 따르는 것이 중요합니다. 3dGRO™ 폐 오가노이드 분지 배지(SCM307) 및/또는 3dGRO™ 폐 오가노이드 성숙 배지(SCM308)의 새 분량을 해동하여 사용하십시오.
2. 접힌 구조를 가진 LBO를 선택하여 Matrigel^® 샌드위치로 이식하십시오. 접힌 구조를 가진 LBO의 예는 그림 3을 참조하십시오.
3. 부유 현탁 배양을 시작하기 전 4일차와 8일차 모두에서 높은 세포 밀도가 관찰되어야 합니다. 세포 유형에 따라 시드 밀도를 조정하십시오.

문제 2: 부유 배양 중 플로팅 LBO가 플레이트 바닥에 부착됩니다.

조직 배양 처리된 24-웰 플레이트나 페트리 접시 대신 초저 부착성 24-웰 플레이트를 사용하십시오.

문제 3: Matrigel^® 샌드위치 배지 교체 후 상층이 부드러워지거나 붕괴됩니다.

샌드위치 상층부에 50µL 대신 75µL의 100% 성장 인자 감소(GFR) Matrigel^® 매트릭스를 첨가하십시오. Matrigel^® 샌드위치가 완전히 굳어지도록 24-웰 플레이트를 인큐베이터에 30분 이상 두십시오.

문제 4: 4일차에 c-kit⁺/CXCR4⁺ 양성 세포 비율이 80% 미만입니다.

4일차에는 80-90% 이상의 양성 세포를 가진 밀집된 c-kit⁺/CXCR4⁺ 세포 군집이 관찰되어야 합니다. 4일차에 성공적인 내배엽 유도 없이 분화를 계속하는 것은 권장되지 않습니다. 고품질의 미분화 인간 iPS 세포 배양을 사용하여 다시 시작하십시오.

문제 5: 성숙 후기 단계에서 배지가 빠르게 황변할 수 있습니다.

이 기간 동안 임베디드 오가노이드는 확대될 수 있으며 일부는 복잡한 돌기를 확장할 수 있습니다(그림 5). 삽입물 상단에 750 µL의 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308)을 추가하고 삽입물 아래 웰에 500 µL를 추가하십시오.