오가노이드 배양 자주 묻는 질문

오가노이드 바이오뱅크란 무엇인가?

맞춤형 의학 연구 응용을 위해 다양한 조직에서 유래한 인간 오가노이드 바이오뱅크가 구축되었으며, 이는 광범위한 세포 및 분자 표현형을 포함합니다. 예를 들어, 정상 및 질환성 위장관 오가노이드 컬렉션을 구축함으로써 대장암 및 크론병, 과민성 대장 증후군(IBS), 궤양성 대장염과 같은 기타 위장관 관련 질환 연구에 기여했습니다.

오가노이드와 스페로이드의 차이점은 무엇인가요?

오가노이드는 어떻게 생성되나요?

오가노이드는 성인 조직(환자 유래 오가노이드, PDO) 또는 다능성 줄기세포(인간 ES/iPSC)에서 유래될 수 있습니다. LGR5+ 줄기세포 집단을 분리 및 증식시키는 것은 오가노이드의 자가 재생 능력을 유지하는 데 매우 중요합니다. 배양에서 오가노이드를 유지하기 위한 다른 중요한 요소로는 로트 인증 GFR Matrigel 사용, 적절한 패싱 기법 준수, 고품질 오가노이드 배지 및 세포 배양 시약 조달 등이 포함됩니다.

오가노이드 배양 프로토콜

• 인간 iPS 세포의체외 대장 오가노이드 분화
• 인간 iPS 세포의체외 기도로 분화
• 항체를 이용한 전체 마운트 오가노이드의 면역형광 염색
• 포스콜린 유도 팽창 분석

종양 오가노이드는 암 연구에서 어떻게 활용되나요?

환자 유래 오가노이드는 건강한 조직과 종양 조직 생검 모두에서 확립될 수 있습니다. 종양 오가노이드(tumoroids)는 종양 내 이질성을 유지하면서 기원이 되는 조직과 종양 하위 유형의 주요 유전적 및 표현형적 특성을 보존하는 것으로 나타났습니다. 최근 종양 PDO(환자 유래 오가노이드)는 체외에서 화학요법 치료 반응을 예측하는 도구로 활용되어, 약물 스크리닝을 통해 새로운 항암 치료법을 식별하는 데 이러한 모델의 중요성을 입증했습니다.

오가노이드는 어떻게 배양되나요?

분리된 오가노이드는 성장인자 감소형 매트릭젤(Growth Factor Reduced Matrigel)과 같은 풍부한 세포외 기질(ECM) 기저막 추출물 하이드로겔에 내장된 특수 배지에서 배양됩니다. 배지는 격일로 교체되며, 세포가 너무 커지거나 괴사하기 전에 일주일에 한 번(7-12일) 세포를 분화시킵니다. 세포는 작은 덩어리 조각으로 또는 기계적분해/효소 없는 분화 시약(passaging reagents)을 사용하여 단일 세포로 분화시킬 수 있습니다. 오가노이드 유형과 접합도에 따라, 오가노이드 분화 시 대략 1:3-1:4의 분할 비율을 사용할 수 있습니다. 민감한 오가노이드 유형의 경우, 분화 과정에서 ROCKi (Y27632) (SCM075)를 첨가하여 세포 생존율을 높일 수 있습니다.

위장관 오가노이드 PDO 프로토콜 가이드

오가노이드 배양에 매트리지엘이 필요한가요?

예, 마트리겔은 오가노이드의 적절한 성장을 촉진하는 데 필수적입니다. 마트리겔 매트릭스는 자연적인 생체 내 3차원 환경을 모방하는 데 필요한 화학적 신호 사이토카인과 구조적 ECM 단백질을 제공합니다. 마트리겔은 오가노이드 배양에 사용되는 마트리겔 돔을 생성하기 위해 종종 희석하지 않은 형태(8 mg/mL 이상)로 사용됩니다. 최근에는 Matrigel 돔을 사용하는 대신 배지에 희석된 Matrigel을 첨가하여 오가노이드의 고처리량 현탁 배양을 생성하고 있습니다.

매트리지엘 돔이란 무엇인가요?

돔 기반 오가노이드 배양법은 단일 매트리지엘 ECM 방울 내에 오가노이드 조각을 접종한 후 중합을 유도하는 방식입니다. 매트리지엘 ECM이 중합되면 돔 상부에 배지를 추가합니다. 일반적으로 웰당 하나의 매트리지엘 돔을 접종합니다.

그림 4. 매트리지엘 돔 오가노이드 배양 기술.

오가노이드 배양에서 매트리지엘을 제거하는 방법은 무엇인가요?

매트리지엘은 1100rpm에서 5분간 원심분리하여 배양 시 제거할 수 있습니다. 원심분리 후, 오가노이드 세포 침전물 위에 보이는 얇은 매트리지엘 층을 조심스럽게 흡입 제거합니다. 오가노이드는 배지 또는 PBS로 세척한 후 추가 매트리지엘을 제거하기 위해 다시 원심분리해야 합니다. 또한, 코닝^® 세포 회수 용액을 사용하여 매트리지엘 돔에서 오가노이드를 회수할 수 있습니다.

오가노이드 배양에 필요한 배지 또는 보충제는 무엇인가요?

각 오가노이드 세포 유형은 고유한 무혈청 배지 세트가 필요합니다. 일반적으로 사용되는 배지 및 보충제에는 고급 DMEM/F12 (SCM162), N-2 (SCM012), N-27 (SCM013), 나이아신아마이드, N-아세틸-L-시스테인, 가스트린 WNTs, R-스폰딘-1, 노긴, FGFs, EGFs 또는 CHIR99021, SB202190, A-83-01과 같은 소분자 억제제 등이 있습니다.

고가의 재조합 단백질 비용을 절감하기 위해 L-WRN (WNT, R-스폰딘, 노긴) (SCM105), R-스폰딘-1 (SCM104) 및 WNT 조건부 배지가 재조합 단백질의 저렴한 대체재로 사용되어 오가노이드 배지를 보충하고 있습니다.

오가노이드는 배양에서 얼마나 오래 확장될 수 있나요?

적절한 배지와 패싱 기법을 사용하여 LGR5+ 줄기세포 집단을 유지한다면 대부분의 오가노이드는 무기한으로 확장될 수 있습니다. 오가노이드의 품질과 동일성을 보장하기 위해 5~10회 패싱마다 마커 발현 및 핵형 분석을 수행하는 것이 권장됩니다.

오가노이드를 어떻게 패싱합니까?

기계적 분해 또는 무효소 패싱 시약을 사용하여 작은 덩어리 조각 또는 단일 세포로 오가노이드를 패싱할 수 있습니다.

오가노이드를 냉동 또는 냉동 보존할 수 있나요?

예. 오가노이드 세포 유형에 따라 최적화된 오가노이드 세포 동결 배지(SCM301)를 사용하여 오가노이드를 냉동 보존할 수 있습니다. 많은 환자 유래 오가노이드 유형이 냉동 보존 가능합니다. 그러나 폐 오가노이드와 같은 일부 iPSC 유래 성숙 오가노이드 세포 유형은 성공적으로 동결할 수 없습니다. 동결 전 세포 생존율을 높이기 위해 오가노이드를 ROCKi (Y27632) (SCM075)로 사전 처리해야 합니다. 제어된 Mr. Frosty 동결 용기를 사용하여 5-10개의 Matrigel 돔을 1개의 크라이오바이알에 동결할 것을 권장합니다. 최고 수준의 세포 생존율을 보장하기 위해 동결 시 각 돔의 평균 오가노이드 밀도는 약 90%여야 합니다.

항체로 오가노이드를 어떻게 염색하나요?

오르가노이드는 전체 표본 염색법 또는 파라핀 포매/절편 기술을 사용하여 면역세포화학(ICC)/면역조직화학(IHC) 분석을 위한 항체로 염색할 수 있습니다. 오르가노이드 분석에 사전 검증된 항체를 사용하는 것이 매우 중요합니다.

프로토콜 가이드: 항체를 이용한 전체 마운트 오가노이드의 면역형광 염색

그림 5.오가노이드의 항체 염색.SARS-CoV-2 관련 항체(ACE2 및 TMPRSS2)로 염색된 대장및 폐 오가노이드.

매트리지엘 배지에서 배양된 오가노이드에서 RNA/DNA를 어떻게 추출하나요?

전통적인 DNA/RNA 분리 키트를 사용하여 시퀀싱(RNA-seq, scRNA-seq, WGS, CHIP-seq 등)을 위한 게놈 물질을 준비할 수 있습니다. 큰 오가노이드를 사용하는 일부 응용 분야에서는 조직 특이적 DNA/RNA 추출 키트를 권장합니다. RNA 추출 전에 분해된 오가노이드에 TRI Reagent(T9424)를 첨가할 수 있으며, 향후 사용 시까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.

오가노이드에 특수한 분석법이 필요한가요?

오가노이드의 가변적 특성으로 인해 대부분의 기존 분석법은 추가적인 실험적 최적화가 필요합니다. 예를 들어, 일반적인 생사세포 생존율 분석법(CBA415)은 오가노이드를 포함한 3차원 배양에 최적화되었습니다. 이 분석법은 칼세인-AM(생세포), 프로피디움 요오드화물(사세포), 호에스트 33342(전체 세포)에 의존합니다. 또 다른 일반적인 오가노이드 분석법은 CFTR 기능을 측정하는 포스콜린 유도 오가노이드 팽창 분석법입니다.

오가노이드를 이용한 세포 독성 분석은 어떻게 수행하나요?

약물 화합물의 세포 독성 효과를 분석하기 위해, 세포 생존율 루시페라제 분석법(SCT149)이나CellTiter-Glo^® 3D 세포 생존율 분석법과 같이 ATP를 측정하는 루시페라제 기반 분석법이 종종 오가노이드 배양에 사용됩니다.

오가노이드 약물 스크리닝 프로토콜

오가노이드 배양에서 변이를 줄이는 방법은 무엇인가요?

인간 대장 오가노이드와 같은 일부 오가노이드 세포 유형은 TrypLE Express 분해 시약을 사용하여 단일 세포 패싱이 가능합니다. 웰당 동등한 수의 오가노이드를 접종하면 기존의 기계적 또는 효소적 덩어리 배양 기술보다 더 균일한 오가노이드 배양을 얻을 수 있습니다. 단일 세포 배양 시에는 세포 생존력을 유지하기 위해 최종 농도 10 μM의 ROCKi Y27632 (SCM075)를 배지에 첨가하는 것이 중요합니다. 분석 변동성을 줄이는 또 다른 기술은 유사한 크기의 오가노이드를 유지하면서 비정상적인 형태의 오가노이드를 수동으로 제거하는 것입니다.

윤리적으로 공급된 인간 오가노이드는 어디서 구입할 수 있나요?

저희는 윤리적으로 공급된 고품질 위장관 PDO(장기유사체) 컬렉션과 iPSC(유도만능줄기세포) 유래 대장 및 폐 장기유사체를 제공합니다.