BioIVT 냉동 보존 자연살해 세포(NK Effector Cells)를 이용한 ADCC 프로토콜

• 팁과 요령
• 항체의존성 세포독성(ADCC)을 위한 재료
• 기기
• 냉동 보존된 NK 효과 세포를 이용한 ADCC 프로토콜
• ADCC 데이터 분석

항체의존성 세포독성(ADCC) 분석법은 면역학 연구, 종양학 연구 및 치료용 항체 개발에 자주 사용됩니다. ADCC 분석에 냉동 보존된 효과 세포를 사용하면 신선하게 분리하거나 배양한 효과 세포에 비해 편리하고 즉시 사용 가능한 대안을 제공할 수 있습니다. 머크의 냉동 보존된 NK 효과 세포를 사용한 ADCC 분석을 위한 프로토콜을 최적화하였습니다. 권장되는 수정 사항이 포함된 최적화된 프로토콜은 아래에 제시되어 있습니다. 분석 성능에 대한 데이터 및 정보는 당사의 기술 문서 "냉동 보존된 NK 세포를 사용한 ADCC 분석"을 참조하십시오.

팁과 요령

시작하기 전에 고려해야 할 몇 가지 핵심 사항이 있습니다:

1. 표적 세포가 표면에 충분한 표적 항원을 발현하는지 확인하십시오. 이는 유세포 분석법(권장) 또는 웨스턴 블로팅을 통해 평가할 수 있습니다.
2. 부착성 표적 세포의 경우, 표적 세포의 균일한 분포가 재현성 있게 달성될 수 있는지 확인하십시오. 균일한 분포를 보장하기 위해 본 프로토콜에 명시된 팁과 요령(그림 2 참조)을 사용하는 것이 권장됩니다.
3. 인간화 항체를 사용할 경우, IgG1, IgG3 또는 IgG1fut(Fc 영역 당쇄 서열의 탈포사화)가 종종 더 나은 결과를 제공합니다.^1-3
4. ADCC에 사용할 항체가 관심 대상 항원에 결합할 수 있는지 유세포 분석을 통해 확인하십시오.
5. 본 프로토콜에서는 동결(냉동 보존)된 NK 세포를 효과기 세포로 사용했습니다. 이 경우 24시간의 살상 시간이 필요했습니다.
6. 실험 시작 전에 계획을 세우십시오. 명확하고 상세한 플레이트 맵을 설계하십시오(그림 1 참조). 다음 매개변수를 고려해야 합니다:
   • 표적 세포의 시드 밀도: 96웰 플레이트에서 웰당 2,000-5,000개의 표적 세포로 시작하는 것을 권장합니다.
   • 효능 세포 대 표적 세포 비율(E:T): ADCC 분석은 항상 높은 E:T 비율에서 더 잘 작동합니다. 그러나 E:T 비율을 높이면 더 많은 NK 세포가 필요하므로 NK 세포의 가용성을 고려해야 합니다. 2:1에서 20:1 사이의 E:T 비율을 테스트할 것을 권장합니다.
   • 항체 농도 조절: 항체는 1 pg/mL에서 1 µg/mL 사이의 농도로 테스트할 것을 권장합니다.
7. 냉동 보존된 NK 세포를 사용할 경우, 해동 후 세포를 재냉동할 수 없다는 점을 유의하십시오. 따라서 주문 시 각 바이알에 적절한 양의 세포가 포함되어 있는지, 그리고 분석에 충분한 수의 바이알을 확보할 수 있는지 확인하십시오. 일반적으로 분석의 실행 가능성을 확인하고 기증자 간 변이를 평가하기 위해 서로 다른 세 명의 기증자로부터 세 개의 바이알(바이알당 5백만 세포)을 주문할 것을 권장합니다.
8. 구매 가능한 충분한 재고를 보유한 기증자로부터 NK 세포를 주문하십시오. 반복 실험이나 향후 실험을 위해 단일 기증자로부터 대량의 NK 세포를 주문하는 것을 고려하십시오.
9. 일반적으로 냉동 NK 세포를 사용할 경우, 강력한 ADCC 분석은 50% 이상의 살상률을 나타냅니다.
10. 필요한 경우, IL-15를 사용하여 NK 세포를 사전 처리함으로써 ADCC 분석을 더욱 최적화할 수 있습니다.

항체의존성 세포독성(ADCC) 분석을 위한 재료

• 세포 배양 배지
  • A549 세포 배양용: 재구성된 F-12 Ham (Kaighn’s modification, N3520)에 10% FBS (ES-009-B), 1X Pen-Strep (TMS-AB2-C) 및 2 mM L-글루타민 (TMS-002-C)을 첨가합니다.
    주의: 여과 전에 NaHCO₃을 최종 농도 2.5 g/L가 되도록 첨가하십시오.
  • NK 세포 배양용: RPMI-1640 (R8758)에 10% FBS (ES-009-B), 1X Pen-Strep (TMS-AB2-C) 및 2 mM L-글루타민 (TMS-002-C)을 첨가합니다.
• DPBS (TMS-012)
• 트립신-EDTA 용액 (T3924)
• 0.4% 트리판 블루 용액 (T8154)
• BioIVT 냉동 인간 정상 CD56+ NK 세포, 음성 선별, HLA 유형 분석 (HUMANHL56-0002824)
• A549 루시퍼라제 발현 세포주
• 항-EGFR (Creative Biolabs #HPAB-AP066-YC)
• 일회용 혈구 계수기 (MDH-2N1)

기기

• 타이틀 플레이트 셰이커 (LAB-LINE Instruments 4625)
• 플레이트 리더 (BioTek Synergy H1)

냉동 보존된 NK 효과 세포를 이용한 ADCC
프로토콜

1일차

표적 세포 준비 (소요 시간: 2시간):

1. T-75 플라스크에서 A549 루시페라제 발현 세포 배양 (표적 세포, <75% 접합도)
2. 배지를 제거하고 플라스크 내 세포를 DPBS 10mL로 신속히 세척합니다.
3. 세포에 트립신-EDTA 용액 3mL를 첨가하고 37°C에서 5분간 배양합니다.
4. 플라스크에 F12K 배지 7mL를 첨가합니다. 배지 표면에 부착된 세포를 씻어내고 잘 재현탁시키기 위해 피펫으로 여러 번 위아래로 흡입합니다.
5. 헤마사이토미터를 사용하여 세포를 계수합니다.
6. 세포를 원심 분리(300 x g, 3분)한 후 F-12K 배지에 5K 세포/240 µL 농도로 재현탁합니다.
7. 검정색 96-웰 플레이트(평평한 투명 바닥)의 각 웰에 세포 현탁액 240 µl를 첨가합니다.
8. 권장 사항: 표적 세포 표준 곡선을 위해 10K 세포/240 µL의 현탁액을 준비하십시오. 그런 다음 F12K 배지에서 1:1 연속 희석액(5K, 2.5K, 1.25K, 625, 312, 156 세포/240 µL/웰)을 중복으로 준비하십시오. 

9. 중요 단계: 조직 배양 후드에서 1시간 동안 배양 접시를 휴지시킨 후 37˚C 인큐베이터로 옮겨 하룻밤 동안 배양합니다. 표적 세포는 웰 바닥에 고르게 분포되어야 합니다(그림 2). *이는 NK 세포 살상 활성에 매우 중요합니다. 분포가 고르지 않은 경우 1단계부터 다시 배양 접시를 옮기십시오.

NK 세포 준비 (소요 시간: 1시간):

10. 냉동 보존된 NK 세포 바이알 1개를 37°C 수조에서 2분간 해동합니다.
11. 세포 용액을 50mL 원심 분리 튜브로 피펫팅합니다.
12. 가열된 RPMI-1640 배지 5mL를 한 방울씩 떨어뜨려 넣습니다.
13. NK 세포 현탁액 10µL를 1.5mL 에펜도르프^® 튜브에 피펫팅합니다. 0.4% 트리판 블루 용액 10µL를 첨가하고 잘 혼합합니다.
14. 혼합액 10µL를 혈구계수판에 피펫팅하여 세포 수와 생존율을 계수합니다.
15. NK 세포를 원심 분리합니다(300 x g, 3분).
16. NK 세포 침전물을 RPMI 배지에서 1M 생존 세포/mL 농도로 재현탁합니다. 총 체적 기준으로 세포를 플라스크/웰 플레이트로 옮깁니다.
17. 선택 사항: 원하는 경우 적절한 농도의 IL-15가 포함된 RPMI-1640 배지에 NK 세포를 재현탁합니다.
18. NK 세포를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

2일차

살상 반응 (시간: 2시간):

19. NK 세포 현탁액 10µL를 1.5ml Eppendorf^® 튜브에 피펫팅합니다. 0.4% 트리판 블루 용액 10µL를 첨가하고 잘 혼합합니다. 생존 NK 세포 수를 계수합니다.
20. NK 세포를 원심분리(300 x g, 3분)한 후, 효과기:표적 세포 비율에 따라 원하는 세포 농도로 RPMI-1640에 재현탁합니다.
    예시: 설계된 E:T 비율은 6:1입니다. 각 웰에 5K 표적 세포가 있으므로, NK 세포는 웰당 30K 생존 세포/120 µL로 재현탁해야 합니다.
    
21. 8채널 매니폴드(Drummond 3-000-093)를 사용하여 표적 세포 플레이트 웰의 배지를 흡입합니다.
    주의: 매니폴드 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 합니다.
22. 살상용 NK 세포 120 µL를 각 웰에 첨가하십시오.
23. RPMI-1640 배지에서 2배 농도의 항-EGFR 항체 용액을 준비하십시오.
    예시: 설계된 항-EGFR 농도가 1 µg/mL인 경우, RPMI-1640 배지로 2 µg/mL 농도로 준비하십시오.
    권장 사항: 먼저 2 µg/mL 항체 용액을 준비한 후, 1:4 연속 희석(400, 80, 16, 3.2, 0.64 및 0.128 ng/mL)을 수행하여 웰 내 항체의 최종 농도가 1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32 및 0.064 ng/mL가 되도록 합니다(그림 1).
    중요 단계: 표적 세포에 의한 항체의 내포작용을 방지하기 위해 항체보다 먼저 NK 세포를 웰에 첨가해야 합니다.
    
24. 각 웰에 120 µL의 항-EGFR을 첨가합니다(최종 웰 부피: 240 µL).
25. 표적 세포 표준 곡선을 위해 준비된 웰에 RPMI-1640 240 µL를 첨가합니다.
26. 플레이트를 37°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
    중요 단계: 냉동 보존된 NK 세포를 효과기 세포로 사용할 경우, 살상 지속 시간을 최적화하는 것이 중요합니다. 일반적으로 신선한 NK 세포를 사용한 ADCC 분석은 6시간 이내에 완료될 수 있지만, 냉동 보존된 NK 세포를 사용한 ADCC 분석은 충분한 살상을 생성하기 위해 하룻밤 동안의 배양이 필요합니다.

3일차

발광 측정 (시기: 2시간):

24시간 후 현미경으로 표적 세포 사멸을 관찰할 수 있어야 함(그림 3)

27. RPMI-1640 배지를 실온으로 가열합니다.
28. SCT150 용해 완충액과 D-루시페린 원액을 실온으로 가열합니다.
29. D-루시페린 스톡을 용해 완충액에 최종 농도 0.25 mg/mL가 되도록 첨가하십시오.
30. 8채널 진공 매니폴드를 사용하여 대상 세포 플레이트의 웰에서 배지를 흡입합니다. 매니폴드의 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오.
31. 각 웰에 RPMI-1640 배지 50 µL를 첨가합니다.
32. 루시페린이 포함된 SCT150 용해 버퍼 50 µL를 각 웰에 첨가합니다.
33. 액체가 넘치지 않도록 주의하면서 Titer Plate Shaker (LAB-LINE Instruments #4625)에서 10분간 플레이트를 흔들어 줍니다. 모든 세포가 용해되었는지 확인합니다(필요한 경우 현미경으로 관찰하여 확인할 수 있음).
34. 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정합니다. 측정값이 분석법의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오.
    
    주의: 발광 신호는 10분 후 급격히 감소합니다. 여러 플레이트를 분석할 경우, 플레이트를 함께 용해하지 마십시오. 또한 각 플레이트마다 고유한 세포 표준을 사용하고 발광 측정이 세포 표준의 선형 범위 내에 있는지 확인하십시오. 발광 측정이 선형 범위를 벗어나는 경우, 신호를 실제 세포 수로 변환하기 위해 곡선 피팅을 사용해야 합니다.

ADCC 데이터 분석

데이터는 세 가지 방식으로 플롯할 수 있습니다:

1. 원시(발광) 신호 대 다양한 효과기 대 표적 세포(E:T) 비율에서의 항-EGFR 항체 농도
2. 세포독성 % 대 다양한 E:T 비율에서의 항-EGFR 항체 농도 (세포독성 계산식):
               세포독성 % = [(최대값 - 배경값) - (실험값 - 배경값)] / (최대값) * 100
   여기서 최대값(Max)은 표적 세포만 존재할 때의 평균 신호를, 배경값(BG)은 표적 세포가 없는
   웰의 평균 신호를, 실험값(Expt)은 실험 샘플을 나타냅니다.
3. 다양한 E:T 비율에서 항-EGFR 항체 농도에 따른 ADCC 백분율 다음 ADCC 계산식을 사용:
   ADCC % = 세포독성 % (항체 존재 시) – 평균 (세포독성 % (항체 부재 시))

생세포 수는 루시페라제 리포터 유전자를 발현하는 A549 세포의 표준 곡선에서 얻은 발광 신호를 사용하여 보간할 수 있습니다.

원신호 대 항체 농도 플로팅

항체 농도에 따른 세포독성 백분율 그래프 작성

            세포독성 % = [(최대값 - 배경값) - (실험값 - 배경값)] / (최대값 - 배경값) * 100

            여기서 Max는 표적 세포만 존재하는 웰의 평균 신호를, 배경(BG)은 표적 세포가 없는
웰의 평균 신호를, 실험군(Expt)은 실험 시료를 나타냅니다.

항체 농도에 따른 ADCC 백분율 그래프 작성

            ADCC % = 세포독성 % (항체 존재 시) – 평균 (세포독성 % (항체 부재 시))