HPLC pour petites molécules

HPLC des petites molécules

L'analyse HPLC des petites molécules est le plus souvent réalisée en mode de séparation en phase inverse. Pour la séparation des composés polaires, la chromatographie d'interaction hydrophile (HILIC) et la chromatographie en phase normale conviennent également, la HILIC étant la méthode préférée. Pour la séparation des composés ioniques, les modes de séparation par échange d'ions et, pour les anions ou cations inorganiques, la chromatographie ionique peuvent également être utilisés.

La colonne HPLC est remplie de particules de silice entièrement poreuses, de particules de silice superficiellement poreuses, de particules polymères ou consiste en une tige de silice monolithique comme phase stationnaire. De plus, de l'oxyde d'alumine, des particules de zircone et des particules de carbone sont utilisés. La taille typique des pores du matériau de la phase stationnaire pour la séparation des petites molécules est comprise entre 60 Å et 160 Å. Pour la HPLC, la taille typique des particules de la phase stationnaire varie de 3 µm à 5 µm, tandis que pour l'UHPLC, on utilise des particules plus petites, généralement de 2 µm ou moins. Différentes sélectivités de colonne (modifications) peuvent être associées à la phase stationnaire. Une chaîne alkyle C18 est la chimie de colonne la plus couramment utilisée en chromatographie en phase inverse (RP). Néanmoins, d'autres modifications, telles que C30, C8, phényle, pentafluorophényle et une large gamme de modifications plus polaires, ainsi que des modifications avec des propriétés d'échange d'ions ou chirales, permettent la séparation de presque tous les composés solubles dans les liquides. La phase mobile pour la RP-HPLC se compose généralement d'un tampon aqueux ou d'eau et de solvants organiques miscibles à l'eau comme l'acétonitrile ou le méthanol.

Préparation d'échantillons pour HPLC

Les échantillons complexes et riches en matrice, tels que les aliments, les boissons, les cosmétiques, les échantillons biologiques et les formulations pharmaceutiques riches en matrice (par exemple, les crèmes, les sirops), nécessitent des protocoles de préparation d'échantillons efficaces afin d'éliminer les composants indésirables et d'extraire de manière sélective l'analyte d'intérêt. Cela est essentiel si l'on utilise une phase stationnaire avec des particules de très petite taille, comme dans l'UHPLC, où des particules de 2 µm ou moins sont utilisées. Les méthodes courantes de préparation des échantillons sont l'extraction liquide-liquide, l'extraction en phase solide (SPE) et, pour les échantillons biologiques, la précipitation des protéines en plus de la filtration. Outre l'élution sélective du composé cible et la préconcentration, l'objectif principal de la préparation des échantillons est de protéger la phase stationnaire HPLC contre le colmatage causé par la matrice de l'échantillon. Les colonnes HPLC à base de silice monolithique tolèrent très bien la matrice et nécessitent beaucoup moins de préparation des échantillons que les colonnes à particules. 

Dérivatisation

Pour certaines molécules, une dérivatisation est nécessaire, soit avant (pré-colonne), soit après (post-colonne) la séparation HPLC. La dérivatisation convertit les molécules en leurs dérivés pour une meilleure sensibilité ou rétention chromatographique en HPLC. Des réactifs chimiques, présentant les propriétés physiques et chimiques souhaitées, sont utilisés pour la dérivatisation requise.