OxyBlotタンパク質酸化検出キット

生理学的および病理学的プロセスでは、酸素フリーラジカルやその他の反応性種によるタンパク質の酸化修飾が生じます。この修飾の結果、部位特異的なメカニズムによってカルボニル基がタンパク質側鎖に導入されます。OxyBlotキットは、タンパク質の酸化状態の特徴であるこれらのカルボニル基を簡単かつ高感度に免疫検出するための試薬を提供します。

細胞ライセートの調製

1.接着細胞をディッシュまたはフラスコ内で氷冷PBSで2回洗浄し、PBSを除去します。非接着細胞をPBSで洗浄し、卓上遠心機で800～1000 rpmで5分間遠心分離して細胞をペレット化します。
2.氷冷したRIPAバッファーを細胞に加えます（107細胞/100 mmディッシュ/150 cm2フラスコあたり1 mL、5 x 106細胞/60 mmディッシュ/75 cm2フラスコあたり0.5 mL）。
3.氷冷蒸留水で冷却したゴム製ポリスマンまたはプラスチック製セルスクレーパーを用いて、接着細胞をディッシュまたはフラスコから剥がし取ります。細胞懸濁液を遠心チューブに移します。低温室内のロッカーまたはオービタルシェーカーで15分間、懸濁液を穏やかに振盪し、細胞を溶解させます。
4.予冷した遠心分離機でライセートを14,000 x gで15分間遠心します。上清を直ちに新しい遠心チューブに移し、ペレットを廃棄します。
5.タンパク質濃度を測定する前に、細胞ライセートを少なくとも1 : 10に希釈します。溶解バッファー中の界面活性剤がクーマシーベースの試薬に干渉するためです。このステップで、サンプルを分注して、-20¡Cで最長1カ月間保存することができます。
TIP：大量の非接着細胞を扱う場合、細胞を十分に急速冷却できず、検討したいタンパク質の活性を維持できない場合があります。この場合は、2xPBSと氷を等量混合したものに細胞懸濁液を入れた後、遠心分離により細胞を回収して、上記のとおり溶解を行ってください。

RIPA溶解バッファー：
カタログ番号20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188

還元剤は酸化を防ぐために非常に重要です。
タンパク質ライセートは、さまざまなプロトコルを用いて調製できます。RIPAやTritonなどの標準的なほとんどのバッファーも適しています。細胞溶解後に起こりうるタンパク質の酸化を防ぐために、溶解バッファーに還元剤を添加することをお勧めします。1～2%の2-メルカプトエタノールまたは50 mM DTTを含む溶解バッファーは、この酸化を十分に阻害でき、OxyBlotプロトコルの誘導体化反応に悪影響を与えることはありません。精製したタンパク質サンプルも、OxyBlotキットを用いた分析に適しています。

タンパク質抽出に関する一般的な情報については、このリンクをご覧ください。

http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction

受領後、タンパク質標準（構成要素90450）は、-25°C～-15°Cで保存してください。 他の構成要素はすべて、2°C～8°Cで保存してください。

CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany

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