Kit de détection de l′oxydation des protéines OxyBlot

Une modification oxydante des protéines par les radicaux libres d'oxygène et d′autres espèces réactives se produit lors des processus physiologiques et pathologiques. Du fait de cette modification, des groupements carbonyle sont introduits dans les chaînes latérales protéiques selon un mécanisme spécifique à chaque site. Le Kit OxyBlot contient des réactifs pour l′immunodétection simple et sensible de ces groupements carbonyle, qui constituent une caractéristique principale de l′état d′oxydation des protéines.

Préparation d′un lysat cellulaire

1. Dans le récipient ou le flacon, laver à deux reprises les cellules adhérentes avec du PBS glacé, puis égoutter le PBS. Laver les cellules non adhérentes dans du PBS et les centrifuger pendant 5 minutes entre 800 et 1000 tr/min dans une centrifugeuse de paillasse afin d′obtenir un culot de cellules.
2. Ajouter du tampon RIPA glacé aux cellules (1 ml par 107 cellules/boîte de 100 mm/fiole de 150 cm2 ; 0,5 ml par 5 x 106 cellules/boîte de 60 mm/fiole de 75 cm2).
3. Racler les cellules adhérentes présentes dans la boîte ou la fiole à l′aide d′un bout en caoutchouc ou d′un grattoir de cellules en plastique préalablement refroidi dans de l′eau distillée glacée. Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger. Agiter doucement la suspension sur un agitateur basculant ou un agitateur orbital dans la chambre froide pendant 15 minutes afin de lyser les cellules.
4. Centrifuger le lysat à 14 000 x g dans une centrifugeuse préalablement refroidie pendant 15 minutes. Transférer immédiatement le surnageant dans un tube à centrifuger propre et jeter le culot.
5. Avant de déterminer la concentration en protéines, diluer au moins au 1/10ème le lysat cellulaire, du fait de l′interférence des détergents contenus dans le tampon de lyse avec le réactif du type Coomassie. À cette étape, l′échantillon peut être divisé en aliquotes et conservé à -20 °C jusqu′à un mois.
CONSEIL : Lorsque la méthode de travail implique de grands volumes de cellules non adhérentes, les cellules risquent de ne pas être refroidies suffisamment vite pour maintenir l′activité de la protéine étudiée. Dans ce cas, verser la suspension de cellules dans un mélange de masses égales de 2 x PBS et de glace, puis récupérer les cellules par centrifugation et les lyser comme indiqué ci-dessus.

Tampon de lyse RIPA :
Référence 20-188
http://www.millipore.com/catalogue/item/20-188

Il est très important d′utiliser un agent réducteur pour empêcher l′oxydation :
Le lysat de protéines peut être préparé selon divers protocoles. La plupart des tampons standard, du type RIPA ou Triton par exemple, conviennent également. Il est recommandé d′ajouter un agent réducteur au tampon de lyse afin d′empêcher l′oxydation des protéines qui est susceptible de se produire après la lyse des cellules. Un tampon de lyse contenant soit 1-2 % de 2-mercaptoéthanol soit du DTT 50 mM permet d′inhiber suffisamment cette oxydation, mais n′a aucun effet indésirable sur la réaction de dérivatisation dans le protocole OxyBlot. Les échantillons de protéines purifiés peuvent aussi être analysés avec le kit OxyBlot.

Pour obtenir des informations d′ordre général sur l′extraction de protéines, cliquez sur ce lien :

http://www.millipore.com/immunodetection/id3/proteinextraction

Dès réception, conserver la protéine étalon (composant 90450) entre -25 °C et -15 °C. Conserver tous les autres composants entre 2 °C et 8 °C.

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