Tests de viabilité et de prolifération cellulaires
Présentation de la section
- Essais de prolifération par synthèse d'ADN
- Tests de prolifération métaboliques
- Tests de viabilité cellulaire par luminescence
- Tests de prolifération par colorant fluorescent
- Culture cellulaire en 3D – Triple coloration « vivantes/mortes/totales »
- Comptage cellulaire au bleu de Trypan
Introduction
Les tests permettant de mesurer la prolifération cellulaire, la viabilité cellulaire et la cytotoxicité sont couramment utilisés pour surveiller la réponse et l'état des cellules en culture après un traitement par divers stimuli. Le choix approprié d'une méthode de test dépend du nombre et du type de cellules utilisées, ainsi que du résultat attendu. Les tests de prolifération cellulaire peuvent permettre de surveiller le nombre de cellules au fil du temps, le nombre de divisions cellulaires, l'activité métabolique ou la synthèse d'ADN. Le comptage cellulaire à l’aide de colorants de viabilité tels que le bleu de Trypan ou la calcéine-AM permet de déterminer à la fois le taux de prolifération et le pourcentage de cellules viables.
Aperçu des tests de viabilité et de prolifération cellulaires
Tests de prolifération par synthèse d'ADN
Test de prolifération cellulaire au BrdU
La prolifération cellulaire peut être étudiée en suivant l'incorporation d'un radio-isotope, la [3H]-thymidine, dans l'ADN cellulaire, puis par autoradiographie. Il est également possible d’utiliser la 5-bromo-2′-désoxy-uridine (tests BrdU) à la place de la thymidine. Les cellules ayant incorporé du BrdU dans leur ADN sont facilement détectées à l’aide d’un anticorps monoclonal dirigé contre le BrdU et d’un anticorps secondaire conjugué à une enzyme ou à un fluorochrome.
Figure 1.A. Cellules en prolifération dans l'œil d'un embryon de poulet au stade E4, mises en évidence par coloration au BrdU. B. Validation de l'anticorps anti-BrdU à l'aide de la camptothécine. En traitant des cellules Jurkat avec la camptothécine, un agent bloquant le cycle cellulaire, les cellules en circulation sont bloquées au niveau de la transition entre les phases G1 et S.
Tests de prolifération à l'EdU
Les tests de prolifération EdU de Baseclick constituent une méthode efficace pour la détection par fluorescence de l’ADN en cours de réplication. Le nucléoside modifié EdU est ajouté à des cellules vivantes et s’incorpore à l’ADN en cours de réplication. La chimie « click » induite par le cuivre permet la fixation rapide de sondes fluorescentes à l’EdU. Cela offre un moyen quantitatif de surveiller les cellules en prolifération. Ces tests sont disponibles sous différents formats pour l’imagerie microscopique, la cytométrie en flux, le criblage à haut débit et les expériences in vivo. Quatre sondes fluorescentes différentes, dont les pics d’excitation sont respectivement de 488, 555, 594 et 647, sont disponibles pour permettre le multiplexage avec d’autres sondes fluorescentes.
Figure 2.Les kits de mesure de la prolifération cellulaire Edu-Click permettent d'intégrer l'EdU (5-éthynyl-2'-désoxyuridine) dans l'ADN au cours de la synthèse active de l'ADN ; les résultats sont ensuite mesurés à l'aide d'une méthode de détection fluorescente basée sur la chimie « click ».
Tests de prolifération métabolique
Les tests mesurant l'activité métabolique permettent d'analyser la prolifération, la viabilité et la cytotoxicité. La réduction des sels de tétrazolium tels que le MTT, le XTT et le WST-1 en composés formazanes colorés, ou la bioréduction de la résazurine, ne se produit que dans les cellules métaboliquement actives. Les cellules en phase de prolifération active augmentent leur activité métabolique, tandis que celles exposées à des toxines présentent une activité réduite.
Tests de prolifération cellulaire au MTT
Le MTT (bromure de 3-[4,5-diméthylthiazol-2-yl]-2,5-diphényltétrazolium ; bleu de thiazolyle) est un sel de tétrazolium hydrosoluble qui donne une solution jaunâtre lorsqu’il est préparé dans des milieux ou des solutions salines dépourvus de rouge de phénol. Le MTT dissous est converti en formazan violet insoluble par clivage du cycle tétrazolium par des enzymes déshydrogénases. Ce formazan insoluble dans l’eau peut être solubilisé à l’aide d’isopropanol ou d’autres solvants, et la substance dissoute est mesurée par spectrophotométrie en utilisant l’absorbance en fonction de la concentration du colorant converti.
Essais de prolifération cellulaire au XTT
Contrairement au MTT, le produit de clivage du XTT est soluble dans l’eau ; une étape de solubilisation n’est donc pas nécessaire. Le sel de tétrazolium XTT est clivé en formazan par un mécanisme cellulaire complexe. Cette bioréduction ne se produit que dans les cellules viables et est liée à la production de NAD(P)H par la glycolyse. La quantité de colorant formazan formée est directement corrélée au nombre de cellules métaboliquement actives dans la culture.
Tests de prolifération cellulaire WST-1
Le sel de tétrazolium stable WST-1 est clivé en formazan soluble par un mécanisme cellulaire complexe qui se produit principalement à la surface cellulaire. Cette bioréduction dépend en grande partie de la production glycolytique de NAD(P)H dans les cellules viables. La quantité de colorant formazan formée est directement proportionnelle au nombre de cellules métaboliquement actives dans la culture.
Guide de protocole : Test WST-1 pour la viabilité et la prolifération cellulaires. Protocoles, FAQ et dépannage
Figure 3.Le test MTT est un test colorimétrique permettant d'évaluer la prolifération cellulaire en se basant sur l'activité métabolique. Les enzymes oxydoréductases cellulaires dépendantes du NAD(P)H reflètent le nombre de cellules viables présentes. Ces enzymes sont capables de réduire le colorant tétrazolium jaune MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium) en formazan insoluble, qui présente une couleur violette.
Dosages luminescents de la viabilité cellulaire
L'ATP étant un indicateur de l'activité métabolique des cellules, le nombre de cellules viables peut être évalué en fonction de la quantité d'ATP disponible. Le test de viabilité cellulaire par luciférase et ATP offre un dosage homogène hautement sensible permettant de quantifier l'ATP dans les cultures cellulaires. Ce kit utilise la luciférase de luciole pour oxyder la D-luciférine et exploite la lumière ainsi produite pour évaluer la quantité d'ATP disponible dans les cultures cellulaires. Cette méthode de dosage sensible consiste en un seul ajout du cocktail de détection de l’ATP directement sur les cellules cultivées dans un milieu enrichi en sérum. Aucun lavage des cellules, aucun retrait du milieu ni aucune pipetage multiple ne sont nécessaires. Le kit est suffisamment sensible pour détecter une seule cellule ou 0,01 picomole d’ATP. Le signal produit est linéaire sur six ordres de grandeur. En établissant un lien entre la quantité d’ATP et le nombre de cellules viables, ce test offre de nombreuses applications, allant de la détermination du nombre de cellules viables à la prolifération cellulaire, en passant par la cytotoxicité cellulaire.
Figure 4.Test de viabilité cellulaire par luciférase ATP bioluminescente. La luciférase de luciole utilise l'ATP pour oxyder la D-luciférine, ce qui entraîne une production de lumière permettant d'évaluer la quantité d'ATP disponible, qui est en corrélation avec le nombre de cellules et leur viabilité.
Tests de prolifération à l'aide de colorants fluorescents
Marquage au CFSE
Le diacétate de 5(6)-carboxyfluorescéine, ester N-succinimidyle (CFSE), est couramment utilisé pour mesurer le nombre de divisions subies par une population cellulaire. Une fois à l’intérieur de la cellule, le CFSE est clivé par des estérases intracellulaires pour former le composé fluorescent, et le groupe succinimidyle réagit de manière covalente avec les amines primaires des protéines intracellulaires. Lors de la division, l’intensité de fluorescence de chaque cellule fille est réduite de moitié, ce qui permet de déterminer facilement le nombre de divisions cellulaires par cytométrie en flux. Le CFSE est largement utilisé pour mesurer la prolifération des lymphocytes, y compris les lymphocytes T.
Double marquage des cellules vivantes/mortes
La double coloration des cellules vivantes/mortes peut être utilisée pour la détection simultanée par fluorescence des cellules viables et des cellules mortes. La calcéine-AM est un colorant hautement lipophile et perméable à la membrane cellulaire. Bien que la calcéine-AM ne soit pas en soi une molécule fluorescente, la calcéine générée à partir de la calcéine-AM par l’estérase dans une cellule viable émet une forte fluorescence verte (λex 490 nm, λem 515 nm). La calcéine-AM ne colore donc que les cellules viables. En revanche, le colorant de nucléus, l’iodure de propidium, ne peut pas traverser la membrane d’une cellule viable. Il atteint le noyau en traversant les zones désorganisées de la membrane des cellules mortes et s’intercale dans la double hélice d’ADN pour émettre une fluorescence rouge (λex 535 nm, λem 617 nm). Étant donné que la calcéine et le PI-ADN peuvent tous deux être excités par une lumière de 490 nm, il est possible de surveiller simultanément les cellules viables et les cellules mortes à l’aide d’un microscope à fluorescence à excitation unique.
Figure 5.Double coloration des cellules vivantes/mortes
Culture cellulaire en 3D – Triple marquage : cellules vivantes, cellules mortes et cellules totales
Le kit d’imagerie de viabilité cellulaire est un test tricolore pouvant être utilisé avec des cultures cellulaires en 2D et en 3D pour la coloration fluorescente simultanée des cellules viables (calcéine-AM), des cellules mortes (iodure de propidium/PI) ainsi que de l’ensemble des cellules (Hoechst 33342).
- La calcéine-AM émet une fluorescence verte lorsqu’elle se lie au calcium, grâce à l’activité estérasique présente uniquement dans les cellules viables métaboliquement actives.
- L’iodure de propidium (PI) est un colorant nucléaire qui est rejeté par la membrane des cellules vivantes, mais qui traverse la membrane endommagée des cellules mortes, où il s’intercale avec l’ADN pour émettre une forte fluorescence rouge.
- Le Hoechst 33342 est un colorant de l’ADN présentant une faible cytotoxicité. Il émet une fluorescence bleue et sert d’indicateur du nombre total de cellules.
Comptage cellulaire au bleu de Trypan
Le bleu de Trypan est l'un des colorants recommandés pour les procédures d'exclusion par coloration visant à compter les cellules viables. Cette méthode repose sur le principe selon lequel les cellules vivantes (viables) n'absorbent pas le colorant bleu, contrairement aux cellules mortes (non viables). La viabilité cellulaire peut être calculée à partir du rapport entre le nombre total de cellules vivantes et le nombre total de cellules (vivantes et mortes). La coloration facilite également l'observation de la morphologie globale des cellules.
REMARQUE : le bleu de Trypan présente une plus grande affinité pour les protéines sériques que pour les protéines cellulaires. Si le fond est trop sombre en raison de la présence de sérum dans la matrice, les cellules doivent être centrifugées puis remises en suspension dans un milieu exempt de protéines ou dans une solution saline avant le comptage.
