In Situ細胞死検出キット、AP

免疫組織細胞化学において、光学顕微鏡下でアポトーシス細胞死を単一細胞レベルで検出・定量できるキットです。

キット内容：

• 酵素溶液（TdT）
• 標識溶液（フルオレセイン-dUTP）
• コンバーターAP（抗-フルオレセイン抗体-AP）、Ready-to-use

In Situ細胞死検出キット、APは、正確、迅速、簡便に、放射線を使用せずに、光学顕微鏡下で細胞や組織のアポトーシス細胞死を単一細胞レベルで検出・定量できる技術です。診断目的での使用はできません。したがってIn Situ細胞死検出キットは多様なアッセイ系で使用することができます。使用例：

• 基礎研究における凍結及びホルマリン固定組織切片の個々のアポトーシス細胞の検出†
• 癌研究における悪性細胞の薬剤誘発性アポトーシスに対する感受性の測定
• 不均質細胞群中で細胞死を起こしている細胞の二重染色によるタイピング

In Situ細胞死検出キット、APは、アポトーシスの初期に生じる一本鎖及び二本鎖DNAの切断を検出します。
アポトーシス細胞を固定、透過性処理した後、TdTとフルオレセイン-dUTPを含有するTUNEL反応混合液とともにインキュベートします。このインキュベーション中にTdTは、フルオレセイン-dUTPが一本鎖又は二本鎖DNAのフリーの3′-OH基に付加される反応を触媒します。洗浄後、DNAの損傷部位に取り込まれた標識が、レポーター酵素アルカリホスファターゼをコンジュゲートした抗-フルオレセイン抗体に捕捉されます。未結合の酵素コンジュゲートを洗浄で除去した後、免疫複合体に保持されたAPが基質と反応して可視化されます。

TUNEL反応では、アポトーシスで生じたDNA鎖の切断部分が優先的に標識されます。これによりアポトーシスを、ネクローシスや、細胞増殖抑制薬又は放射線によるDNA鎖の一次切断と識別することができます。

アポトーシスの測定には、アガロース-ゲル電気泳動によるゲノムDNA解析や、³H-チミジン又は5-ブロモ-2′-デオキシ-ウリジンを用いたDNA断片化アッセイなどが広く使用されています。これらの方法では、対象の細胞群の断片化された低分子量DNAと断片化されていない高分子量DNAを分離します。したがってこれらの方法では、対象の細胞群、特に組織切片中の個々の細胞の運命についての情報が得られません。別の方法として、個々のアポトーシス細胞は核クロマチンの濃縮や断片化などの形態的な特徴によって顕微鏡で検出することができますが、この方法は主観的であり、また形態的変化が最大となっている比較的狭い時間枠内での観察に制限されます。
アポトーシスの特徴はDNAの断片化であり、初期段階ではヌクレオソーム間のDNAリンカー領域に選択的に切断されます。DNAの切断では、二本鎖の切断と一本鎖の切断（ニック）が生じます。いずれの切断タイプでも、酵素反応によりフリーの3′-OH末端を標識ヌクレオチド（ビオチン-dUTP、DIG-dUTP、フルオレセイン-dUTPなど）で標識して検出することができます。酵素terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）は、一本鎖又は二本鎖DNAの3′末端にテンプレート非依存的にデオキシリボヌクレオチドを重合する反応を触媒します。この方法はTUNEL（TdT-mediated dUTP-X nick end labeling）という用語でも表されます。また別に、フリーの3′-OH基はDNAポリメラーゼを用いてテンプレート依存的なメカニズムで標識することができ、これはニックトランスレーションと呼ばれます。しかしTUNEL法はより感度が高く迅速な方法であると考えられています。

サンプル材料：サイトスピン、細胞スメア、スライド上で成長させた接着細胞、凍結及びパラフィン包埋組織切片。

3コンポーネントを含む1キット

標準溶液：酵素溶液全量（50 μL）を450 μLの標識溶液に加え、500 μLのTUNEL反応混合液とします。
よく混合して成分を均一にします。
保存条件（標準溶液）：TUNEL反応混合液
TUNEL反応混合液は使用直前に調製してください。保存はできません。TUNEL反応混合液は使用まで氷上に静置してください。

コンバーターAP
コンバーターAP溶液は融解後2～8℃で保存してください（最長で
6ヵ月安定）。
注：凍結させないでください。

ライフサイエンス研究専用。診断目的での使用はできません。