TeloTAGGG^™テロメア長アッセイ

テロメアは、真核生物染色体の末端に位置する特殊なDNAタンパク質構造体であり、小さな、直列に反復したDNA配列から構成されます。テトラヒメナのような系統学的に多様性のある生物間でさえも、非常に少ない配列変異を示す多数のテロメア配列が同定されています（配列：TTGGGG) およびヒト（配列：TTAGGG）。
DNAポリメラーゼは、線状DNAのまさに末端を複製できないので、染色体末端は各複製サイクルに伴い次第に短くなることが示唆されました（「末端複製問題」と呼ばれます）。本現象は、in vitroおよびin vivoで実証されており、正常な体細胞の限られた増殖能力（「有糸分裂時計」）に関連しているように思われます。生殖系列細胞、幹細胞、および腫瘍細胞はすべて長期または無限の寿命さえも示すので、これらの細胞はテロメア長を維持するための特異的メカニズムを有するにちがいないことが示唆されました。
安定したテロメア長を維持することは、テロメラーゼの活性化と関連しています。本酵素は、DNA合成のテンプレートとしてその内因性のRNA構成要素を使用して、染色体末端に反復配列を付加することによりテロメアDNAの喪失を補うリボヌクレオタンパク質です。
テロメアは、構造タンパク質に特異的に結合することにより、細胞内の真核生物染色体の安定した維持という点で本質的な役割を果たします。これらのタンパク質は線状染色体の末端にキャップすることにより、核酸分解、末端間融合、不規則な組換え、および通常は細胞にとって致命的な他の事象を防止します。
ヒト末梢血単核細胞の研究サンプルのテロメア長の分析により、これらの細胞の複製履歴を反映しながら、ドナーの加齢につれてテロメア長が減少することが判明しました。いくつかの疾患（例：ダウン症候群、毛細血管拡張運動失調、およびHIV感染）では、促進されたテロメア喪失が報告されており、テロメア長の減少がこれらの疾患に関連する免疫機能障害に関連している可能性があることが示唆されています。このキットは、これらの関係についての科学的知見を増やすことを目的としています。

アッセイ時間：約18時間
サンプル材料：細胞培養および他の生体サンプル

テロメア長を測定する非放射性化学発光アッセイ。

本キットは、頻繁に切断する制限酵素を用いてゲノムDNAを断片化することにより得られる末端制限断片（TRF）のサザン分析を利用しています。
ステップ1：ゲノムDNAの断片化
精製ゲノムDNAは、高頻度に切断する制限酵素の最適化された混合物により断片化されます。酵素は、テロメアDNAとサブテロメアDNAが切断されないように選択されています。これは、特殊な反復配列特性によるものです。非テロメアDNAは、低分子量の断片に断片化されます。
ステップ2：ゲル電気泳動とサザンブロッティング
DNA断片化後、DNA断片をゲル電気泳動により分離したのち、サザンブロッティングによりナイロンメンブレンに移します。
ステップ3：ハイブリダイゼーションと化学発光検出
ブロットされたDNA断片をテロメア反復に特異的なジゴキシゲニン（DIG）標識プローブとハイブリダイズさせたのち、アルカリホスファターゼに共有結合したDIG特異的抗体とともにインキュベートします。最後に、アルカリホスファターゼ用の高感度の化学発光基質、CDP-Starにより、固定されたテロメアプローブを可視化します。平均TRF長は、シグナルを分子量標準と比較することにより決定できます。

TeloTAGGG^™テロメア長アッセイは、以下のライフサイエンス研究用途での使用を意図してデザインされています。

• 細胞培養物および他の生物学研究用サンプル中のテロメアDNAの高感度検出（テロメア配列：TTAGGG）
• 細胞培養物および他の生物学研究サンプル中のDNAのテロメア長の測定

1キットに15コンポーネントが含まれています。

ワーキング濃度：抱合体のワーキング濃度は用途と基質に左右されます。

以下の濃度をガイドラインとして解釈してください：

• ドットブロット：100 ng/mL
• ELISA：100 ng/mL
• ウエスタンブロット：100 ng/mL

ワーキング溶液：TAE緩衝液
0.04 Mトリス酢酸塩、0.001 M EDTA、pH 8.0
HCl溶液
0.25 M HCl
200 cm²のブロットに対して約250 mLの溶液が必要です。
変性溶液
0.5 M NaOH、1.5 M NaCl
200 cm²のブロットに対して約500 mLの溶液が必要です。
中和溶液
0.5 MトリスHCl、3 M NaCl、pH 7.5
200 cm²のブロットに対して約500 mLの溶液が必要です。
20倍SSC
3 M NaCl、0.3 Mクエン酸ナトリウム、pH 7.0
2倍SSC
20倍SSC（溶液5）をオートクレーブ滅菌済の再蒸留水で1：10の比に希釈します。
DIG Easy Hyb顆粒
本顆粒（ボトル8）を、64 mLのオートクレーブ滅菌済の再蒸留水で復元調製し、完全に復元調製されるまで37℃でインキュベートします。溶液は、使用する数時間前に調製します。
厳密な洗浄緩衝液I
2倍SSC、0.1% SDS
厳密な洗浄緩衝液II
0.2倍SSC、0.1% SDS
1倍洗浄緩衝液
適量の10倍洗浄緩衝液（ボトル10）を、オートクレーブ滅菌済の再蒸留水で1：10の比に希釈します。
1倍ブロッキング溶液
適量の10倍ブロッキング緩衝液（ボトル12）を、1倍マレイン酸緩衝液（溶液12）で1：10の比に希釈します。
1倍マレイン酸緩衝液
適量の10倍マレイン酸緩衝液（ボトル11）を、オートクレーブ滅菌済の再蒸留水で1：10の比に希釈します。
抗DIG-AP、ワーキング溶液
凝集した抗体によるバックグラウンドを抑えるため、使用前にバイアルを13,000 rpmで5分間遠心してください。
適量の抗DIG-AP（ボトル13）を、1倍ブロッキング溶液（溶液11）で最終濃度75 mU/mL（1：10,000）に希釈します。
1倍検出緩衝液
適量の10倍検出緩衝液（ボトル14）を、オートクレーブ滅菌済の再蒸留水で1：10の比に希釈します。
保存条件（ワーキング溶液）：TAE緩衝液：
15～25℃で安定
HCl溶液
15～25℃で安定
変性溶液
15～25℃で安定
中和溶液
15～25℃で安定
20倍SSC
15～25℃で安定
2倍SSC
15～25℃で安定
DIG Easy Hyb
15～25℃で3ヵ月間安定
厳密な洗浄緩衝液I
15～25℃で安定
厳密な洗浄緩衝液II
15～25℃で安定
1倍洗浄緩衝液
洗浄緩衝液15～25℃で安定
1倍ブロッキング溶液
使用直前に調製します。保存しないでください
1倍マレイン酸緩衝液
15～25℃で安定
抗DIG-AP、ワーキング溶液
使用直前に調製します。保存しないでください
1倍検出緩衝液
15～25℃で安定

プローブの配列と長さは機密情報です。キットの中のDIG標識MWは、DIG MW IIIとVIIの混合物です。

ライフサイエンス研究専用です。診断的処置に使用しないでください。

Geron Corporation社からのライセンス下で製造されています。

TeloTAGGG is a trademark of Roche