T7 RNA ポリメラーゼ

T7 RNA ポリメラーゼは、方向性の異なる2種類のファージプロモーターを有するベクターにクローニングされた DNA の転写に一般的に使用されます。RNA は、インサート DNA のいずれの鎖からも、異なるポリメラーゼを使用して選択的に合成可能です。このシステムでは、均一に標識された 1 本鎖の RNA を合成できます。転写物は、ビオチンまたは DIG-11-UTP による非放射標識、または [α-³²P] または [α-³⁵S]-標識ヌクレオチドによる高比活性放射標識が行えます。

ハイブリダイゼーションプローブの合成：T7 RNA ポリメラーゼは、均一に標識された RNA の高い効率での生成を可能にします。標識された RNA はサザンブロット、ノーザンブロットおよびドットブロットならびに in situ ハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーションプローブとして使用できます。
適切な標識：転写物はビオチン-16-UTP または DIG-11-UTP を使用して非放射標識が行えます。[α-32P]- または [α-35S]-標識ヌクレオチドにより、高比活性放射標識を行うことも可能です。

プロモーター特異性
T7 RNA ポリメラーゼは極めてプロモーター特異的であり、バクテリオファージ T7 DNA または T7 プロモーター下流の DNA のみを転写します。T7 および T3 のプロモーター配列の差はわずか 3 bp ですが、T7 RNA ポリメラーゼはそのプロモーターの下流にクローニングされた DNA のみを転写します。
熱不活化：0.2 M EDTA（pH 8.0）の 2 μL の添加および65°Cの加熱、またはそのいずれかにより反応を停止します。

1 キットには 2 つの成分が含まれます。

活性剤：T7 RNA ポリメラーゼは BSA またはスペルミジンにより高度に活性化されます。

容器を密閉し、乾燥した換気の良い場所で保管してください。

1ユニットは、1 nmol の CMP を酸沈降 RNA 産物に+37°Cにおいて 60 分間以内に取り込む酵素活性に相当します。

容量活性：≥20 U/μL

試験バッファー
40 mM Tris-HCl、pH 8.0（+20°C）、6 mM MgCl2、10 mM ジチオスレイトール、2 mM スペルミジン、pH 約 8.0（+20°C）。
エンドヌクレアーゼ不含
1。1 μg のラムダ DNA を T7 RNA ポリメラーゼと共に 25 μL の試験バッファー中+37°Cで 4 時間インキュベーションします。ラムダ DNA の分解を示さない酵素ユニット数は >100 Uです。
2.ラムダ DNA の Eco RI/Hind III フラグメント1 μg を T7 RNA ポリメラーゼと共に 25 μL の試験バッファー中+37°Cで 4 時間インキュベーションします。バンドパターンの変化を示さない酵素ユニット数は >100 Uです。
ニッキング活性不在
1 μg の pBR322 DNA を T7 RNA ポリメラーゼと共に 25 μL の試験バッファー中+37°Cで 4 時間インキュベーションします。スーパーコイル構造の緩和を示さない酵素ユニット数は >100 Uです。
RNase 不含
4 μg の MS2 RNA を T7 RNA ポリメラーゼと共に 50 μL の試験バッファー中+37°Cで 4 時間インキュベーションします。MS2 RNA の分解を示さない酵素ユニット数は >100 Uです。
転写活性性能
T7 RNA ポリメラーゼは、SP6/T7 Transcription キット（カタログ番号10 999 644 001）における性能試験が行われています。Eco RI および 50 mCi [alpha-32P] CTP、[400 Ci/mmol (15 Tbq/mmol)] で直線化した 0.5 μg の pSPT19 neo DNA によるスタンダードアッセイにおける取り込み率は 20 分間でインプット放射活性の 50%を超えています。

ライフサイエンス研究専用。診断目的には使用できません。
Roche は、DIG またはビオチンの標識用に特別にデザインされた 10 倍濃縮 RNA Labeling Mixes を提供しています。これらの混合物は、T7 RNA ポリメラーゼとの使用に適しています。